Одна из основных проблем в инженерии ткани сердца человека включает в себя его васкуляризации. Наша лаборатория разработала в пробирке модель человеческого сердца путем совместного культивирования клеток, найденных в виво. К ним относятся сердечные миоциты, сердечные фибробласты и сердечные эндотелиальные клетки.
Все вместе эти клетки позволяют перепроверить микроокноронность сердца человека, включая его молекулярные, клеточные и дополнительные клеточные компоненты. Мы используем их в нашей лаборатории для тестирования различных препаратов на эссе о токсичности наркотиков. К ним относятся доксорубицин, известный кардиотоксический препарат, который поражает сердца человека даже спустя годы после его лечения.
Мы культурируем сердечные фибробласты, эндотелиальные клетки и миоциты отдельно перед формированием сфероидов. Для того, чтобы вырастить кардиомиоциты, мы собираем флакон от минус 80 градусов и нагреваем его при температуре 37 градусов в течение четырех минут на водяной бане. Затем мы распылим флакон крио с 70%этанолом и переместим его в шкаф для биобезопасности.
Мы аккуратно собираем подвеску клетки и переатрат ее в 15-миллилитровую трубку Falcon. Мы собираем один миллилитр довоенной пластины среды, промыть крио флакон один раз, а затем добавить его в 50 миллилитров Сокол трубки, одна капля в то время, каждые четыре секунды. В то время как добавить в покрытие среды, осторожно встряхните трубку Сокола.
С помощью клеточной пипетки соберите семь миллилитров покрытия среды и аккуратно добавьте его в 15-миллилитровую трубку Falcon. После добавления конечного объема покрытия среды в трубку Falcon, передача клеточной подвески в фибронектин закодированных фляги ткани. Наконец, перемести ячейки в инкубатор.
Через два дня мы собираем флябы из инкубатора и проверяем слияние клеток под микроскопом. В этот момент мы переместим колбу в шкаф для биобезопасности и удалим покрытие среды. Мы аккуратно промыть клетки с той же средой покрытия из ткани колбу четыре или пять раз.
Мы заменяем его свежим средством технического обслуживания и переместим в инкубатор еще на один-два дня. В день, когда мы создаем завесы культур, мы собираем все три типа клеток из инкубатора. Мы чип в клетках, удалив средства массовой информации.
Мы промыть их с тремя миллилитров PBS. И, наконец, мы добавляем чипы в клетки. Затем колбы перемещаются в инкубатор и инкубируется на срок до пяти минут.
Для того, чтобы генерировать сердечные сфероиды, мы со-культуры 20000 клеток на висячие капли. К ним относятся 10 000 кардиомиоцитов, тысяча сердечных фибробластов и 5000 сердечных внутренних клеток. Эти co-культурные в вися падении 384 наилучшим образом плиты.
Они помылись с помощью нашей жидкостной системы обработки. Мы также добавляем PBS на боковинах висячих пластин падения, чтобы предотвратить культур от высыхания в инкубаторе. Аккуратно переместите висящую пластину капли, содержащую клетки, в инкубатор.
Через три-четыре дня сформируются сфероиды. Мы собираем висячие пластины капли из инкубатора, и мы проверяем, что сфероиды формируются в каждой хорошо. Как показано на этих изображениях, у нас есть набор сфероидов в центре каждой хорошо.
После образования мы собираем сфероиды и встраиваем их в коллагеновые гели. Наконечник пипетки разрезают внутри, чтобы предотвратить повреждение сфероидов. Сфероиды собираются и переносятся в 50-миллилитровую трубку Falcon, где они собраны вместе.
Мы вращаем суспензию сфероида при 300 G в течение пяти минут, чтобы отделить их от среды. Мы используем темные стены 96 пластин хорошо для изображения сфероидов, средства массовой информации удаляется или заменяется коллагеновым гелем в трубке Сокола. Гидроксид натрия добавляется в суспензию сфероидного геля, прежде чем они помылись в темной пластине стены.
100 микролитров суспензии сфероида добавляют в каждую колодец и инкубируется в течение 30 минут при 37 градусах. Препараты, в том числе доксорубицин и другие агенты добавляются в сфероидную пластину и инкубируется в течение 24 часов. На следующий день мы подготовили раствор, содержащий кальций AM и ethidium homodimer, маркировка живут под клетками соответственно.
Это решение подготовлено в добавлении копейки к этой фильтровальной пластине. Сфероиды затем инкубируется при 37 градусах в течение одного часа. Мы используем считыватель пластин для измерения флуоресценции кальция AM и их ethidium homodimer в пластине.
Эти измерения затем используются нашим программным обеспечением для выполнения статистического анализа. Мы измеряем контрактную активность сфероидов, обработанных различными препаратами с помощью ионооптической системы. Сфероиды перемещаются на сцену между двумя электродами.
Это позволяет как контролировать, так и измерять контрактную деятельность по потенциалу на местах. Таким образом, мы можем протестировать различные напряжения и частотные диапазоны, чтобы стимулировать сфероиды. Сфероид в то время изображен, и используется для этих измерений.
Сфероиды, которые не получили доксорубицин, смогут построить после электрической стимуляции. Напротив, доксорубицин обработанных сфероидов не будет контракт. Чтобы визуализировать форму эндотелиальной клеточной сети в каждом сфероиде, мы зафиксировали их раствором 4%paraformaldehyde в течение одного часа при комнатной температуре.
Мы перенесли пластину в шейкер, который позволяет мягко пронизывания раствора через гель. PFA удаляется и промывается три раза с раствором PBS, содержащим 0,01% оксида натрия. Мы принесли мобилизации, конечно, добавив 0,02%решение Triton X в PVSA в течение 20 минут при комнатной температуре.
Блокирующий раствор содержит 3%BSA в PBC, который затем добавляется в тарелку в течение одного часа при комнатной температуре. Раствор, содержащий первичное антитело против CD 31. Маркер для эндотелиального добавляется к пластине, которая затем инкубируется на ночь при четырех градусах.
На следующий день первичный раствор антитела удаляется, и пластина трижды промывается раствором PBS, содержащим 0,01% оксида натрия. Вторичный раствор антитела, содержащий шестиугольное пятно, также добавляется к пластине, которая затем инкубируется на ночь при четырех градусах. Наконец, второй раствор антитела удаляется и пластины промыть три раза с раствором PBS, содержащий 0,01% оксида натрия.
После пребывания с первичными и вторичными антителами, пластина может быть изображена с помощью нашего конфокального микроскопа. Надлежащая сосудистая сеть имеет решающее значение для выживания и функционирования сердечных клеток. Сердечные сфероиды представляют эндотелиальную клеточную сеть, которая лучше резюмирует тот, который присутствует в сердце человека по сравнению с монослойными культурами сердечных клеток.
Учитывая уникальные особенности, сердечные сфероиды представляют собой передовые инструменты для тестирования в пробирке для сердечно-сосудистых исследований.
