Протокол сочетает в себе возрастную изоляцию спонтанных смешанных культур, полученных из нервных стволовых клеток, содержащих дифференцирующие клетки-предшественники олигодендроцитов и астроциты, анализы, имитирующие патологические состояния, и надежные показания с высоким содержанием. Эти характеристики позволяют дифференциально изучать миелинизацию развития и ремиелинизацию у взрослых в физиологических и патологических состояниях и в микросреде, учитывающей вклад астроцитов. Для выделения нервных стволовых клеток с эмбрионального дня с 13,5 до 14,5 плодного переднего мозга поместите головки эмбрионов в чистую чашку Петри с ледяным холодным PBS и используйте щипцы для удаления кожи с черепа под увеличением.
Как только мозг будет виден и очищен от кожи, используйте щипцы, чтобы выдавить мозг из черепа и удалить мозжечок. Используйте щипцы для удаления мозговых оболочек и поместите изолированную ткань в буфер неферментативной диссоциации. Когда вся мозговая ткань будет выделена, вытяните два-три образца в 150 микролитрах буфера неферментативной диссоциации на 1,5 миллилитровую трубку и инкубируйте трубки в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием.
В конце инкубации добавьте 850 микролитров стандартной среды в каждую трубку и пипетку, чтобы перемешать, пока суспензия не освободится от комков. Если недиссоциированная ткань все еще видна, дайте образцам отдохнуть в течение двух минут, чтобы ткани осели на дне трубок. Когда диссоциация завершена, пластинчатые клетки плотностью от 10 до 50 клеток на микролитр в концентрации от 10 до 30 миллилитров нейросферы в колбе Т25 или Т45 и помещают колбу в инкубатор клеточной культуры в вертикальное положение, чтобы предотвратить прикрепление клеток.
от 2,5-месячных взрослых мышей поместите мозг от четырех до пяти взрослых мышей в 50-миллилитровую трубку ледяного HBSS и поместите один мозг, вентральной стороной вниз, в рострально-каудальном направлении на стерильную колбу, покрытую алюминиевой фольгой, заполненную холодной водой минус 20 градусов по Цельсию. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить обонятельные луковицы и вырезать два-три корональных среза толщиной в один миллиметр от коры до оптической хиазмы. Поместите ломтики на холодную поверхность в вентродорсальное положение и определите мозолистое тело и два боковых желудочка.
Используя увеличение, изолируйте стенки боковых желудочков, следя за тем, чтобы не включать кусочки мозолистого тела, и поместите изолированную ткань в пять-10 миллилитров буфера ферментативной диссоциации для 15-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации пипетку тканей не менее 50 раз перед инкубацией образцов при 37 градусах Цельсия в течение дополнительных 10 минут. В конце инкубации нейтрализуют трипсин пятью миллилитрами стандартной питательной среды и фильтруют тканевую суспензию через 70-микронный фильтр.
Центрифугируют отфильтрованный раствор в течение пяти минут при 400 г и повторно приостанавливают гранулу в растворе сахарозы для второго центрифугирования. В конце центрифугирования повторно суспендируют гранулу в растворе для промывки альбумина в сыворотке крупного рогатого скота для другого центрифугирования, затем повторно приостанавливают гранулу в стандартной питательной среде для подсчета и обложите ячейки вертикальной колбой Т-25 или Т-45. Для первичной дифференцировки невросферы добавляйте основные факторы роста фибробластов и эндотелия в культуру нервных стволовых клеток каждые два дня.
Когда невросферы достигают диаметра от 100 до 500 микрон, прохождение клеток путем механической диссоциации в соответствии со стандартными протоколами. Для дифференцировки олигосферы обрабатывайте клетки основным фактором роста фибробластов в факторе АА, полученном из тромбоцитов, каждые два дня. Когда олигосферы достигнут диаметра от 100 до 150 микрон, диссоциируют сферы механической диссоциацией в соответствии со стандартными протоколами и засейте клеточную суспензию с плотностью 3000 клеток на квадратный сантиметр на пластины, покрытые поли-DL-орнитиновым ламинином.
Через три дня замените супернатант каждой культуры одинаковым объемом среды дифференцировки олигодендроцитов. Для выполнения опосредованной воспалением индукции блока дифференцировки, после диссоциации невросфер и во время производства олигосферы добавляют интересующую цитокиновую смесь в культуральную среду. Чтобы вызвать гибель клеток кислородно-глюкозной депривации, через два дня после посева в многолуночные пластины переносят надосадочный агент из каждой культуры в отдельные лунки многолуночной пластины.
Добавьте половину объема среды OGD в скважины и перенесите культуры в герметичную камеру гипоксии, насыщенную 95% азотом и 5% углекислым газом. Поместите камеру в инкубатор клеточных культур. Через три часа замените среду в камерах средой, отведенной от многолуночной культуральной пластины.
После проверки качества окрашивания клеток в меню «Приобретение» программного обеспечения для скрининга с высоким содержанием выберите Фиксированное время экспозиции и мини-сканирование и выберите 10 полей на скважину и две скважины на экспериментальное условие, чтобы параметры анализа в подмножестве полей были установлены для всей пластины. Следуйте рабочему процессу шаг за шагом, чтобы разработать весь алгоритм. Выберите Обработать изображение для каждого канала и нажмите Удаление фона, чтобы выбрать нужный уровень сигнала.
Чтобы определить и выбрать ядра с помощью ядерного окрашивания, щелкните Идентифицировать первичный объект, настроить пороговое значение для идентификации отдельных ядер и щелкнуть Проверить первичные объекты, чтобы установить пороговые значения на основе областей и положения объекта. Щелкните Определить пятна для каждого канала, соответствующие определенным маркерам линии, и установите ширину кольца равным трем, а расстояние нулем, чтобы можно было идентифицировать цитоплазматическую флуоресценцию. Выберите Опорные уровни в рабочем процессе, чтобы построить анализ и разрешить автоматический подсчет конденсированных ядер на основе размера ядра и интенсивности ядерного окрашивания, а также конкретных маркер-положительных клеток на основе цитоплазматической флуоресценции, идентифицированной кольцом, затем нажмите кнопку Воспроизвести.
Во время первой фазы культуры нервные стволовые клетки сохраняют свою экспрессию нестина. Большинство клеток также являются NG2-положительными. CNPase-положительные клетки, соответствующие стадии преолигодендроцитов, обнаруживаются через три-шесть дней после Индукции дифференцировки, опосредованной Т3, в то время как зрелые MBP-положительные олигодендроциты появляются в значительном проценте через шесть-12 дней in vitro.
Скрининговый анализ с высоким содержанием позволяет обнаруживать отдельные клетки в культуре с помощью ядерного окрашивания и анализа интенсивности флуоресценции. Состав культуры в конце фазы дифференцировки различается в зависимости от того, имеют ли культуры фетального или взрослого происхождения, причем фетальные культуры более чувствительны к Т3-опосредованной дифференцировке и достигают более высокого процента зрелых олигодендроцитов. Обратите внимание, что когда нейронные стволовые клетки-предшественники олигодендроцитов засеиваются с высокой плотностью, они агрегируются, и реплицирующиеся астроциты быстро производят сливающийся клеточный слой, предотвращая наблюдение характерной формы паутинной сети зрелых олигодендроцитов.
Опосредованная воспалением, блокирование дифференцировки вызывает сильное снижение предварительных и зрелых олигодендроцитов, что обнаруживается окрашиванием CNPase и MBP как в фетальной, так и во взрослой культурах. Увеличение количества клеток-предшественников олигодендроцитов также происходит в культурах взрослых, обработанных цитокинами. В то время как клетки-предшественники фетала и взрослых олигодендроцитов показывают одинаковое воздействие воспалительных цитокинов, только культуры плодного происхождения чувствительны к токсичности кислородно-глюкозной депривации.
Метод может быть реализован с любым видом клеток-предшественников олигодендроцитов, интерференцирующим процесс дифференцировки и созревания, для тестирования новых стратегий, направленных на борьбу с заболеваниями, влияющими на миелинизацию или ремиелинизацию
