Наш протокол представляет собой оптимизированный инструмент для изучения сердца рыбок данио in vivo и описывает внедрение методов иммобилизации вместе с конвейером сбора и анализа данных для визуализации сердца. Рыбка данио - это сердечная модельная система с большим потенциалом для применения, такого как скрининг лекарств. Протокол, который обеспечивает щадящую визуализацию в физиологических условиях, имеет решающее значение при изучении сердечных заболеваний.
Рабочий процесс, представленный здесь, фокусируется на визуализации эмбрионального сердца рыбок данио, но модифицированная версия может быть применена к различным другим образцам и экспериментам, включая кальмаров, червей и гидру. Начните со сбора эмбрионов, полученных в результате разведения желаемых трансгенных линий. Держите эмбрионы при температуре 28 градусов по Цельсию в чашке Петри, наполненной рыбной средой E3.
Используйте стеклянную иглу, установленную на микроманипуляторе и подключенную к инъектору пико, чтобы ввести 30 пикограмм мРНК альфа-бунгаротоксина в желток эмбрионов одной или двух клеточных стадий, чтобы обездвижить рыбу. Храните яйца при температуре 28 градусов по Цельсию в чашке Петри, наполненной средой E3, и переносите яйца каждые 24 часа в новую посуду, содержащую свежую среду E3, до получения изображения. Чтобы предотвратить образование пигмента, если фон у рыбок данио не является альбиносом, перенесите рыбу через 25 часов после оплодотворения в новое блюдо, содержащее среду Е3 с ингибитором 0,2 миллимолэ тирозиназы 1-фенил2-тиомочевина, также известным как ПТУ.
Для выпрямления фторированной этиленпропиленовой трубки поместите трубку в безопасную трубку из стеклянного или стального автоклава с правильным внутренним диаметром, чтобы поместить полимерные трубки и автоклав при 180 градусах Цельсия в течение двух часов. Как только трубки достигнут комнатной температуры, удалите выпрямленную полимерную трубку. Для очистки трубки используйте 50-миллиметровый шприц, чтобы дважды промыть трубку одним моляром гидроксида натрия.
Нарежьте трубку до размера 50-миллилитровой центрифужной трубки, поместите в центрифужную трубку, заполненную 0,5 моляром гидроксида натрия и ультразвуком на 10 минут. Промыть фторированную этиленпропиленовую трубку двойной дистиллированной водой, а затем 70% этанолом. Перенос трубок в свежую центрифужную трубку содержал 70% этанола и ультразвука в течение 10 минут.
После ультразвуковой обработки промыть трубку в последний раз двойной дистиллированной водой и хранить ее в центрифужной трубке, содержащей двойную дистиллированную воду. После растворения агарозы с низкой температурой плавления в среде Е3 перелить расплавленную агарозу в стеклянную или пластиковую чашку Петри, чтобы получить одно-двухмиллиметровое покрытие. Как только агароза затвердеет, аккуратно вылейте среду E3 поверх агара, чтобы предотвратить высыхание.
Запечатайте пластину парафиновой пленкой и храните при четырех градусах Цельсия. Разморозьте запасной раствор трицина и добавьте 0,02% трикаина в среду E3 без метилового синего для использования в качестве среды для встраивания. Используйте одноразовую стеклянную пипетку для переноса рыбы во встраиваемую среду.
Убедитесь, что рыба перестала двигаться и сердце бьется с той же скоростью, что и контрольная. Вырежьте фторированную этиленпропиленовую трубку до идеальной длины лезвием бритвы. Приготовьте шприц с тупым концом канюли.
Наполните шприц воздухом, затем установите трубку на иглу и осторожно смойте оставшуюся воду, опорожнив шприц. Далее заполните фторированную этиленпропиленовую трубку, установленную на шприце, средой. Вставьте эмбрион в трубку, держа голову рыбы близко к концу трубки, избегая образования пузырьков.
Используя лезвие бритвы, аккуратно отрежьте трубку по краю тупого конца канюли или иглы. Выбрасывая любую жидкость на верхнюю часть чашки, покрытой агаром, погрузите трубку прямо в агар. Поверните трубку и выньте ее, чтобы освободить пробку от агарозного слоя.
Проверьте наличие агаровой пробки на конце трубки. Для долгосрочной визуализации вырежьте три-пять отверстий в трубке в каждом направлении света, по крайней мере, на пять миллиметров выше конца рыбы, поместив лезвие бритвы перпендикулярно оси трубки и сделайте разрез в трубке под углом 30 градусов до достижения монтажной среды. Затем сделайте второй разрез под углом 180 градусов, чтобы создать отверстие и сверните трубку, чтобы четко визуализировать разрезы.
Перенесите смонтированный эмбрион в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую встраиваемые среды, до готовности к изображению. Установите трубку в держатель для образцов и заполните камеру визуализации встраиваемыми средами. Поместите держатель образца на сцену, а образец погружается в камеру.
Проверьте здоровье встроенных рыб, визуально оценив частоту сердечных сокращений, и если сердцебиение слишком медленное, отбросьте образец. Всегда используйте одно и то же положение образца для воспроизводимой визуализации и поворачивайте рыбу так, чтобы оба глаза находились в фокальной плоскости. Затем поверните рыбу примерно на 20-30 градусов против часовой стрелки в течение 48 часов после оплодотворения.
Когда рыба приспособится к мощности лазера, выберите сторону освещения, которая дает наилучшее качество изображения. На каждой плоскости Z записывайте от четырех до пяти сердечных сокращений со скоростью 300 кадров в секунду или более. Чтобы записать бьющееся сердце, переместите образец поэтапно через световой лист и используйте Z-расстояние от одного до двух микрометров, чтобы покрыть всю глубину сердца.
Загрузите 4D-файл в программное обеспечение для 3D-рендеринга для изучения данных и создания фильмов о сердце рыбки данио. Через 48 часов после оплодотворения сердце только что подверглось петле и имеет две камеры, желудочек и предсердие, но еще не развило клапаны. Различные структуры сердца, такие как желудочек, атриовентрикулярный канал, предсердие, приток и отток, легко различимы.
Данные указывали на точное биение и выявили сложные взаимодействия между двумя клеточными слоями сердца, миокардом, одноклеточным мышечным слоем, сокращающимся и генерирующим силу, и эндокардом, одним клеточным слоем, соединяющим сердце с сосудистой системой. Самое главное — всегда проверять работоспособность образца и постоянное сердцебиение под стереоскопом. В то время как обычные методы часто влияют на форму или функцию сердца, наши методы предоставляют нам динамические невозмутимые данные о бьющемся сердце, которые помогают нам понять основы раннего эмбрионального сердца.
