Оценка числа дофаминергических нейронов в чернильной субстанции является ключевым показателем результатов в исследованиях болезни Паркинсона. Этот протокол значительно сокращает рабочую нагрузку, необходимую для оценки числа нейронов. Этот метод обеспечивает эффективный и точный по времени процесс обнаружения изменений в количестве дофаминергических нейронов и подходит для определения влияния вмешательств на выживание клеток.
Этот метод может быть легко адаптирован для обеспечения точного подсчета нейронов в разных областях мозга, сохраняя при этом преимущества в стоимости и времени по сравнению с традиционными стереологическими методами. Для захвата изображений IHC используют программное обеспечение, связанное с конфокальным микроскопом с 10-кратным увеличением. Откройте отверстие для штифта до 1,5 единиц области, чтобы захватить широкую плоскость общей площадью 1,5 микрометра и установить фокус на вводимой стороне мозга.
На вкладке сбора проверьте параметр изображения сканирования плитки и установите размеры 10 на четыре. Под панелью режима захвата установите масштаб на 1,1, чтобы избежать сшивания между изображениями сканирования плиток. Установите размер кадра 1024 на 1024 пикселя, а усреднение — два, чтобы обеспечить высокое качество получения изображения.
На панели каналов установите трек один на Alexa 488 и трек два на Alexa 555. Загрузите слайд на сцену и выберите участок с сильным окрашиванием TH. Нажмите на прямую трансляцию на панели приобретения.
В панели каналов устанавливают силу лазера и коэффициент усиления до уровней, которые максимизируют сигнал и ограничивают фоновый шум. Используйте индикатор диапазона, чтобы убедиться, что сигналы не переэкспонированы. Повторите это с несколькими слайдами.
На вкладке приобретения установите флажок Позиции. Чтобы начать визуализацию, используйте окуляр и выберите первый участок, показывающий положительное окрашивание TH. Затем установите фокус в интересуемой точке и переместите стадию в среднюю линию раздела.
Это сохранит положение на осях X, Y и Z и создаст изображение сканирования плитки, захватывая весь раздел. Повторите это для всех других слайдов, включая неинъекционный сайт. Разделите файлы изображений с помощью соответствующего программного обеспечения и импортируйте их в автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений.
Определите интересующую область, выбрав инструмент аннотации пером, чтобы нарисовать аннотацию вокруг substantia nigra pars compacta. Перейдите на вкладку анализа и выберите настройку в реальном времени в раскрывающемся меню анализа. Откроется отдельное окно на изображении раздела, позволяющее в режиме реального времени изменять параметры анализа.
В разделе увеличения анализа выберите соответствующий масштаб изображения. В разделе обнаружения клеток выберите ядерный краситель в качестве красителя, используемого для окрашивания TH. Отрегулируйте порог ядерного контраста, минимальную ядерную интенсивность, агрессивность ядерной сегментации и настройки размера ядерного оружия, внимательно следя за окном настройки времени.
Повторите этот процесс с несколькими образцами. После того, как соответствующее количество изображений было отобрано и настройка в режиме реального времени была соответствующим образом скорректирована, сохраните настройки анализа в раскрывающемся меню действий настроек. Выберите все изображения для анализа и нажмите на кнопку «Анализировать».
Выберите только что сохраненный параметр анализа и в области окна анализа установите флажок слоев аннотации, затем установите флажок слой один и нажмите на анализ. После завершения экспортируйте данные суммарного анализа для всех разделов, выбрав опцию экспорта данных анализа объектов. Этот набор данных может быть использован для изучения изменений размера клеток в ответ на токсин или терапевтический.
Через шесть недель после инъекций аденоассоциированного вируса или AAV стереотаксическая инъекция AAV, экспрессирующего мутантный альфа-синуклеин A53T, в черную субстанцию в мозге крыс привела к значительному снижению плотности дофаминергических нейронов. Среднее число TH-положительных нейронов на миллиметр в квадрате в черную субстанцию крыс, которым вводили AAV-A35T, было значительно уменьшено по сравнению с крысами, которым вводили пустой вектор AAV. Аналогичные наблюдения были сделаны с использованием непредвзятой стереологии.
При попытке использовать этот протокол имейте в виду, что программное обеспечение полезно настолько, насколько оно обучено. Поэтому необходимо уделять время и осторожность, чтобы гарантировать, что одна клетка идентифицирована как одна клетка. Программное обеспечение может быть адаптировано для измерения интенсивности флуоресценции других интересующих белков, таких как альфа-синуклеин, чтобы определить, могут ли методы лечения модулировать уровни белка.
Этот метод позволил повысить эффективность при тестировании влияния нескольких потенциальных терапевтических средств на плотность дофаминергических нейронов.
