Этот протокол может быть использован для изучения раны индуцированной полиплоидизации. Процесс восстановления тканей, в котором клетки растут, а не делятся на взрослую плодовую муху. Простая колотая рана может быть сделана, чтобы вызвать полиплоидию в эпителии мухи в течение всего двух дней.
Эпителиальный размер клеток, ploidy и организации, затем могут быть оценены легко. Начните с сбора двух флаконов, содержащих от 10 до 15 недавно закрытых самок плодовых мушек штамма интереса. И старение мух в свежих пищевых флаконах, с примерно пятью мужскими мухами на флакон при 25 градусах по Цельсию, до трех-пяти дней.
Для раны брюшной полости, в конце инкубации, используйте один 0,1 миллиметра нержавеющей стали булавку, чтобы собрать несколько держателей булавки, с острым концом каждого контактного ходить. Обезболивать пожилых самок плодовых мушек на площадке для мух с углекислым газом под стерео микроскопом. И использовать кисть, чтобы организовать мух в ряд.
Ношение защитных очков, с булавкой в одной руке и миппы в другой, использовать типсы для позиции мух с их брюшной полости лицом вверх. Затем прокол взрослой самки мух в эпителиальной синей правой области цели A4 по обе стороны от брюшной средней линии перемешать ночи и вернуть раненых мух в пищевой флакон до желаемой экспериментальной точки времени после травмы. На экспериментальной конечной точке, проверьте наличие раны и шрама в каждой анестезированные летать под стерео микроскопом и заполнить один колодец из девяти хорошо стекла рассечения блюдо с раствором Грейс.
Используя пару типсов, возьмите раненую самку мухи за спинную сторону грудной клетки и погрузите муху в колодец раствора. С другой стороны, используйте вторую пару типсов, чтобы проколоть и удалить спинную кутикулу ниже цели A6, в задней части плодовой мухи. Если внутренние органы не извлечены, нанесите давление на спинную сторону живота, чтобы выжать оставшиеся органы.
Используйте типсы, чтобы отрезать полный живот на стыке грудной клетки над целью A2 и передать живот в колодец, содержащий около 100 микролитров раствора Грейс. Когда все животы были собраны, уменьшить объем раствора Грейс в коллекции хорошо до 30 микролитров. Используйте миппы в одной руке, чтобы держать спинную сторону живота вниз и использовать другую руку, чтобы вставить нижнее лезвие весенних ножниц Венеции в брюшную полость каждого живота и вырезать вдоль спинной средней линии, пока животы полностью открыты.
Добавьте 30 микролитров раствора Грейс в каждую монтажную область сухой рассеченной пластины с 4,1 миллиметрами булавок на область монтажа брюшной полости и поместите филе живота в капельку раствора. Когда все животы были филе и помещены, приколоть животы к блюду на четырех спинных углах. Забота о том, что ткани лежат ровно, не разрывая и не перенапряжения брюшной ткани.
Затем замените раствор Grace на 30 микролитров фиксаторным раствором на область монтажа. И поместите ленту этикетку на дне каждого блюда, чтобы отметить каждый контроль и экспериментальной группы. Чтобы смонтировать образцы ткани мухи.
После окрашивания используйте типсы для отсоедискоревания брюшной полости от вскрытой пластины под стерео микроскопом. И использовать типсы для передачи каждого образца по спинной фланг примерно в 30 микролитров монтажной среды на отдельных стеклянных крышках скользит. Под стерео микроскопом ориентируются брюшной ткани так, что внутри сталкивается вниз к крышке скольжения и использовать миппы тянуть ориентированных животов к краю каждой капли средств массовой информации.
Поместите каждую установленную крышку скольжения на помечены стеклянные слайды. И использовать лабораторные ткани, чтобы удалить излишки монтажа среды. Затем запечатать края крышки скольжения с четким лаком для ногтей и хранить слайды в слайд-бокс на четыре градуса по Цельсию до их изображения.
Септатный узел белка быстро три, который этикетки клеточных соединений клеток, обеспечивает показатель того, какие-либо возмущения обработки произошло во время подготовки. Брюшные пятна с большими царапинами необлященной области, которые возмущаются области раны, должны быть отброшены и не включены в анализ. Ремонт раны завершается, когда центральная большая многонуклеированная клетка покрывает раневую парши.
Пробелы более 10 микрометров на эпителиальной простыне считаются дефектами в замыкании ран и повторной эпителиализации. В этом репрезентативном анализе с использованием мух с ингибируется активация митотических клеток, 52% ран были не в состоянии сформировать непрерывный эпителиальный лист над раны парши. Эта мембрана раны исцеления эссе предоставляет более подробную информацию о степени дефекта ремонта раны позволяет повторно эпителиализации дефектов, которые будут сгруппированы как либо полностью открыты, частично закрыты или полностью закрыты.
Например, в этом эксперименте ингибирование раны индуцированной полиплоидизации путем одновременного блокирования репликации эндо и клеточного синтеза, в результате что на 92% эпителиальных ран остаются полностью открытыми. В то время как активация цикла митотических клеток привела к дефекту эпителиальной раны закрытия. Кроме того, активность клеточного цикла была обнаружена путем включения тимидинового аналога ЭДУ, а эпителиальная плоидия определялась путем непосредственного измерения содержания ядерной ДНК.
При вскрытии брюшного эпителия, заботиться, чтобы не прикасаться к ткани с любым из разбирающих инструментов, как это будет поцарапать образец. После вскрытия, пролиферации клеток, гибели клеток, размера разреза потери клеток или оценки содержания ядерной ДНК могут быть выполнены, чтобы лучше понять раневую полиплоиду. или других процессов в эпителии.
