При хронической инфекции HBV Т-клетки CD4 играют важную роль как в вирусном клиренсе, так и в возврате. Этот метод позволяет нам одновременно оценивать специфические ответы CD4 Т-клеток HBV и идентифицировать эпитопы CD4-клеток HBV. Продемонстрировать процедуру будет Цзяньмэй Сяо, научный сотрудник.
И Син Ван, техник из Билао. Для начала изолируйте мононуклеарные клетки периферической крови, или НБМК, из крови, используя центрифугирование градиента плотности Фиколла в 800 раз больше G в течение 20 минут. Затем соберите гранулоциты между слоем эритроцитов и эритроцитов, используя пастеровую пипетку.
Перенесите размороженный клеточный суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку, добавьте один миллилитр предварительно нагретой бензоназы RPMI 1640, по капле, затем медленно добавьте еще шесть миллилитров. Промыть криокомакон двумя миллилитрами бензоназы RPMI 1640, чтобы извлечь оставшиеся клетки. Затем центрифугируют пробирку в 400 раз G в течение 10 минут.
Удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке. Осторожно повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитрах теплой бенсеназы NACE RPMI 1640. Осторожно перемешайте клетки и отфильтруйте их через 70-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, если видны какие-либо клеточные сгустки.
Подсчитывайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Повторно суспендирует НБМК и полную питательную среду, содержащую 10 единиц на миллилитр IL2 и 10 нанограммов на миллилитр IL7. Отрегулируйте плотность ячеек от 1,5x10 до 6 ячеек на миллилитр.
Затем облицовка ячеек в 96-щелетки с плоским дном пластинами с плотностью от 3х10 до пятой ячейки на скважину. Добавьте вирус гепатита В или пулы пептидов, полученных из HBV, в каждую скважину. Для фона и положительного контроля скважин добавьте одинаковое количество растворителя.
Инкубируют пластины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На третий день дополняйте питательную среду 50 единицами на миллилитр IL2 и 10 нанограммами на миллилитр IL7. На седьмой день замените половину питательной среды свежей средой, содержащей: четыре микрограмма на миллилитр пептидов, 100 единиц на миллилитр IL2 и 20 нанограммов на миллилитр IL7.
На 10-й день аккуратно пипетку клеток в каждой скважине семь-девять раз, чтобы дезагрегировать кластеры клеток. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток и перенесите 2x10 в пятую клетку в каждую скважину круглой нижней пластины с 96-ю скважинами для анализа ответа CD4 T-клеток на ВПЧ. Для остаточных клеток в пластине с плоским дном 96-Лунки отрегулируйте объем питательной среды до 100 микролитров, отбросив избыточную среду.
Затем дополняют культуру 100 микролитрами свежей, полной питательной среды, содержащей: четыре микрограмма на миллилитр пептидов, 100 единиц на миллилитр IL2, и 20 нанограмм на миллилитр IL7. Продолжайте культивирование клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа для идентификации эпитопа на 12-й день. Промыть ячейки в круглой нижней пластине с 96 лункой, добавив 200 микролитров RPMI 1640, центрифугируя пластину в 550 раз G в течение трех минут и отбрасывая супернатант.
Повторите промывку дважды, используя полную питательную среду для последней промывки. На каждую лунку клеток, стимулируемых определенным пептидным пулом, добавляют 200 микролитров полной питательной среды, дополненной тем же пептидным пулом. Для background Control Well добавьте полную питательную среду, дополненную одним микролитом на миллилитр DMSO.
Для positive Control Well добавьте полную питательную среду, дополненную одним микролитром на миллилитр DMSO, 150 нанограммами на миллилитр PMA и одной микромолью на литр иономицина. Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе в течение шести часов. После одного часа инкубации добавьте в культуру 1,37 мкг на миллилитр моненсина.
После завершения шестичасовой инкубации центрифугируют пластину в 550 раз G в течение трех минут. Удалите супернатант и промыть клетки один раз 200 микролитрами DP, как было продемонстрировано ранее. Окрашивание для поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8, а также маркер жизнеспособности.
После приостановки ячеек с помощью вибратора, затем охладите пластину при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После однократного промывания пластины 200 микролитрами DPBS зафиксируйте и пронизывайте клетки, окрашивайте внутриклеточными цитокинами, TNF Alpha и Interferon-gamma, а также охлаждаем пластину при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут. Промыть клетки еще раз и повторно приостановить их в 150 микролитрах буфера проточной цитометрии.
Затем получите данные проточной цитометрии с помощью проточная цитометрия. Поддерживайте аллергенных линий B-лимфобластоидных клеток, или BLCL, в колбе T-75. На 12-й день расширения PBMC подсчитайте количество жизнеспособных BLCL и перенесите их на 15-миллилитровые центрифужные трубки.
Центрифугируют клетки в 350 раз G в течение 10 минут и удаляют супернатант. Повторно суспендрить клеточную гранулу и полную культурную среду. Затем аликвотировать LCL на 96-луночную круглую нижнюю пластину при 4x10 до четвертой клетки на лунку и 80 микролитров полной питательной среды.
Добавьте 10 микрограммов на миллилитр одного пептида и установите два фоновых элемента управления. Пульсация пептида при блокировании HLADR и пульсации DMSO. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, в течение двух часов.
Добавьте 100 мкг на миллилитр Митомицина С и инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа. Промыть пластину три раза 200 микролитрами RPMI 1640 для удаления непублированного пептида и митомицина С, затем повторно суспендировать клетки в 120 микролитрах полной питательной среды, используя вибратор. На 12-й день расширения PBMC перенесите НБМК на 96-скважинную круглодонную пластину.
Центрифугируют ячейки в пластине, удаляют супернатант и дважды промывают их 200 микролитрами RPMI 1640, как было продемонстрировано ранее. Повторно приостановите МПК в каждой скважине с 210 микролитрами полной питательной среды. Для PBMC Wells, выбранного для идентификации эпитопов, аликвотирует 70 микролитров клеточной суспензии и смешивается с пептидными импульсными LCL в трех скважинах, включая два фоновых элемента управления.
Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение шести часов. После одного часа инкубации добавьте в культуру 1,37 мкг на миллилитр моненсина и доведите конечный объем в каждой лунке до 200 микролитров с полной питательной средой. В этом репрезентативном примере ответы альфа-и интерферон-гамма-секретировок CD4 Т-клеток для пула пептидов Core11 ниже, чем в два раза, фоновые значения, следовательно, считаются отрицательными.
Между тем, ответы на пул пептидов Core09 выше, чем в два раза больше фона, и считаются положительными. Серый фон указывает на Уэллса с положительным ответом CD4 Т-клеток, а пептиды-кандидаты для идентификации эпитопов обозначены красным цветом, Core01 имеет самую высокую частоту ответа, судя по клеткам, секретифицивающим CD4T клетки TNF и интерферон-гамма в пулах пептидов колонки. Пептиды C1 до 15, C31 до 45, C61 до 75 и C91 до 105 в этом пептидном пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, поскольку ряд пептидных пулов, содержащих эти пептиды, также показывает положительные результаты.
НБМК, расширенные пулами пептидов Core07, 08, 09 и 10, используются для эпитопной идентификации этих пептидов. Аналогичным образом, Core09 имеет самый высокий уровень отклика в пулах пептидов строк. Все пептиды в этом пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, а PBMCs, расширенные пулами пептидов: Core01, 02, 03, 04, 05 и 06 используются для эпитопной идентификации этих пептидов.
Для пептидного пула Core08 расширенных МПК, после стимуляции пептидом С31 до 45 импульсных БЛКЛ, частоты TNF Альфа и Интерферон-гамма секретирующие CD4 Т-клеток в два раза выше, чем фоновые контрольные. Таким образом, пептид C31-45 является проверенным HLADR ограниченным CD4 Т-клеточным эпитопом. Именно там, дополнительные расширенные НБМК остались после идентификации эпитопа.
Тонкая маркировка идентифицированных эпитопов может быть выполнена с помощью панели укороченные пептиды.
