في عدوى HBV المزمنة ، تلعب خلايا CD4 T أدوارا مهمة في كل من إزالة الفيروس والعائدين. تمكننا هذه الطريقة من تقييم استجابات خلايا CD4 T الخاصة ب HBV وتحديد الأسطح المحددة لخلايا CD4 T الخاصة ب HBV، في وقت واحد. وسوف يكون إثبات الإجراء جيانمي شياو، وهو مساعد باحث.
و شينغ وان فني من بيلاو للبدء، قم بعزل خلايا الدم الأحادية النووية الطرفية، أو PBMCs، عن الدم، باستخدام الطرد المركزي المتدرجة لكثافة Ficoll عند 800 مرة G لمدة 20 دقيقة. ثم، وجمع المحببات بين طبقة خلايا الدم الحمراء، وذلك باستخدام ماصة البستر.
نقل تعليق الخلية المذابة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، إضافة ملليلتر واحد من البنزيناز RPMI 1640 قبل تسخينها، وإسقاط الحكمة، ثم إضافة ببطء آخر ستة ملليلتر. شطف قارورة التبريد مع اثنين من ملليلتر من بنزوناسي RPMI 1640 لاسترداد الخلايا المتبقية. ثم طرد أنبوب في 400 مرة G لمدة 10 دقائق.
إزالة supernatant وتخفيف بيليه عن طريق النقر على الأنبوب. بلطف إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الدافئة بينسيناز NACE RPMI 1640. اخلط الخلايا برفق، ورشحها من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر، إذا كانت هناك أي كتل خلايا مرئية.
عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام تريبان الأزرق ومقياس الدم. إعادة تعليق PBMCs وكاملة ثقافة المتوسطة، التي تحتوي على 10 وحدات لكل ملليلتر IL2، و 10 نانوغرام لكل ملليلتر IL7. ضبط كثافة الخلية إلى 1.5x10 إلى 6 خلايا لكل ملليلتر.
ثم لوحة الخلايا في 96-جيدا لوحات أسفل مسطحة في كثافة 3x10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر. إضافة فيروس التهاب الكبد B أو BV تجمع الببتيد المشتقة إلى كل بئر. للخلفية والتحكم الإيجابي ويلز، إضافة نفس الكمية من المذيبات.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث، تكملة المتوسطة الثقافة مع 50 وحدة لكل ملليلتر من IL2، و 10 نانوغرام لكل ملليلتر من IL7. في اليوم السابع، استبدل نصف الوسط الثقافي بوسط طازج يحتوي على:أربعة ميكروجرامات لكل ببتيدات ملليلتر، و100 وحدة لكل ملليلتر IL2، و20 نانوجرام لكل ملليلتر IL7.
في اليوم 10، ماصة بلطف الخلايا في كل بئر سبع إلى تسع مرات إلى مجموعات الخلايا ديس الكلي. عد عدد الخلايا القابلة للحياة ونقل 2x10 إلى الخلايا الخامسة في كل بئر من لوحة أسفل مستديرة 96-Well لتحليل استجابة الخلايا CD4 T المحددة لفيروس الورم الحليمي البشري. بالنسبة للخلايا المتبقية في اللوحة السفلية المسطحة 96-Well، قم بضبط حجم متوسط الثقافة إلى 100 ميكرولتر عن طريق التخلص من الوسط المفرط.
ثم، تكملة الثقافة مع 100 ميكرولتر من الطازجة، وسط ثقافة كاملة، تحتوي على: أربعة ميكروغرام لكل الببتيدات ملليلتر، 100 وحدة لكل ملليلتر IL2، ans 20 نانوغرام لكل ملليلتر IL7. مواصلة زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتحديد epitope في اليوم 12. غسل الخلايا في لوحة أسفل جولة 96-Well بإضافة 200 ميكرولتر من RPMI 1640، والطرد المركزي لوحة في 550 مرة G لمدة ثلاث دقائق، والتخلص من supernatant.
كرر الغسيل مرتين باستخدام وسيط ثقافة كاملة للغسيل الأخير. لكل بئر من الخلايا التي تحفز مع بركة الببتيد محددة، إضافة 200 ميكرولتر من الثقافة الكاملة المتوسطة تكملها مع بركة الببتيد نفسه. لمزيد من التحكم الخلفية، إضافة ثقافة كاملة المتوسطة، تكملها مع ميكرولتر واحد لكل ملليلتر من DMSO.
لمزيد من التحكم الإيجابي، أضف وسيط ثقافة كاملة مكملا بميكرولتر واحد لكل ملليلتر DMSO، و150 نانوجرام لكل ملليلتر PMA، وميكرومول واحد لكل لتر من الأيونوميسين. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. بعد ساعة واحدة من الحضانة، أضف 1.37 ميكروغرام لكل ملليلتر مونينسين إلى الثقافة.
بعد اكتمال الحضانة لمدة ست ساعات، طارد مركزي لوحة في 550 مرة G لمدة ثلاث دقائق. إزالة supernatant وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من DPPs، كما هو موضح سابقا. وصمة عار لعلامات السطح CD3، CD4 و CD8، وعلامة الجدوى.
بعد تعليق الخلايا مع هزاز، ثم تبريد لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد غسل لوحة مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من DPBS، وإصلاح و permeabilize الخلايا، وصمة عار للسيتوكينات داخل الخلايا، TNF ألفا وإنترفيرون غاما، وتبريد لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. غسل الخلايا مرة أخرى، وإعادة تعليقها في 150 ميكرولتر من تدفق التخزين المؤقت للخلايا.
ثم، الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام مقياس التدفق الخلوي. الحفاظ على خطوط الخلايا المسببة للحساسية B-الليمفاوية، أو BLCLs، في قارورة T-75. في اليوم الثاني عشر من توسعة PBMC، احسب عدد BLCLs القابلة للتطبيق، ثم قم بنقلها إلى 15 أنبوب طرد مركزي ملليلتر.
طرد الخلايا في 350 مرة G لمدة 10 دقائق وإزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية وكاملة الثقافة المتوسطة. ثم aliquot BLCLs إلى لوحة أسفل جولة 96 جيدا في 4x10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر، و 80 ميكرولتر من المتوسط ثقافة كاملة.
إضافة 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الببتيد واحد، وتعيين اثنين من عناصر التحكم الخلفية. الببتيد النابض مع حجب HLADR، والنبض DMSO. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ساعتين.
أضف 100 ميكروغرام لكل ملليلتر ميتوميسين سي واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. غسل لوحة ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من RPMI 1640 لإزالة الببتيد غيرpulsed وMitomycin C، ثم إعادة تعليق الخلايا في 120 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة، وذلك باستخدام هزاز. في اليوم 12 من التوسع PBMC، نقل PBMCs إلى لوحة أسفل جولة 96-Well.
طرد الخلايا في لوحة، وإزالة supernatant، وغسلها مرتين مع 200 ميكرولتر من RPMI 1640، كما هو موضح سابقا. إعادة تعليق PBMCs في كل بئر مع 210 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة. بالنسبة الآبار PBMC التي تم اختيارها لتحديد epitope، aliquot 70 ميكرولتر من تعليق الخلية ومزيج مع الببتيد نبض BLCLs في ثلاثة آبار، بما في ذلك اثنين من عناصر التحكم الخلفية.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. بعد ساعة واحدة من الحضانة، أضف 1.37 ميكروغرام لكل ملليلتر monensin إلى الثقافة وبذلك يصل الحجم النهائي في كل بئر إلى 200 ميكرولتر مع وسيط ثقافة كاملة. في هذا المثال التمثيلي، TNF Alpha و Interferon-gamma تفرز استجابات الخلايا T CD4 للببتيد تجمع Core11 أقل من ضعفين قيم الخلفية، وبالتالي، تعتبر سلبية.
وفي الوقت نفسه، فإن الردود على تجمع الببتيد Core09 أعلى من ضعف الخلفية، وتعتبر إيجابية. الخلفية الرمادية تشير ويلز مع استجابة خلية CD4 T إيجابية والببتيدات مرشح لتحديد epitope يشار إليها باللون الأحمر، Core01 لديه أعلى معدل استجابة، استنادا إلى كل من TNF ألفا وإنترفيرون غاما إفراز خلايا CD4T في برك الببتيد العمود. الببتيدات C1 إلى 15، C31 إلى 45، C61 إلى 75، و C91 إلى 105 في هذا التجمع الببتيد، يتم تعيين الببتيدات المرشحة كما صف من برك الببتيد التي تحتوي على تلك الببتيدات تظهر أيضا نتائج إيجابية.
وتستخدم مركبات PBMCs الموسعة مع برك الببتيد Core07 و 08 و 09 و 10 لتحديد هذه الببتيدات. وبالمثل ، Core09 لديها أعلى معدل استجابة في برك الببتيد الصف. يتم تعيين جميع الببتيدات في هذا التجمع والببتيدات المرشحة وPBMCs توسعت مع برك الببتيد:Core01, 02, 03, 04, 05 و 06 وتستخدم لتحديد epitope من هذه الببتيدات.
للببتيد تجمع Core08 PBMCs الموسعة، بعد التحفيز مع الببتيد C31 إلى 45 BLCLs نبضي، وترددات TNF ألفا وانترفيرون غاما إفراز خلايا CD4 T هي مرتين أعلى من عناصر التحكم الخلفية. وهكذا، الببتيد C31 إلى 45 هو التحقق من HLADR المقيد CD4 تي الخلية epitope. وكان هناك، وتبقى مركبات PBMCs إضافية موسعة بعد تحديد الظهارة.
يمكن إجراء وضع علامات دقيقة على الأسطح المحددة باستخدام لوحة من الببتيدات المختصرة.
