בזיהום כרוני HBV, תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים הן בסיווג הנגיפי והן בשוחזרים. שיטה זו מאפשרת לנו להעריך תגובות ספציפיות לתאי CD4 T של HBV ולזהות אפיטופים ספציפיים לתאי CD4 T, בו זמנית. מדגים את ההליך יהיה Jianmei שיאו, עוזר מחקר.
ושינג וואן, טכנאי מבילאו. כדי להתחיל, לבודד תאים מונונוקלאריים דם היקפי, או PBMCs, מדם, באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות פיקול ב 800 פעמים G במשך 20 דקות. לאחר מכן, לאסוף את granulocytes בין שכבת תא הדם האדום, באמצעות פיפטה פסטר.
העבר את ההשעיה התא המפושר לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, להוסיף מיליליטר אחד של RPMI RPMI 1640 בנזונאז התחמם מראש, טיפה חכם, ולאחר מכן לאט להוסיף עוד שישה מיליליטר. לשטוף את בוויאל cryo עם שני מיליליטר של RPMI 1640 בנזונאז כדי לאחזר את התאים הנותרים. ואז צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.
הסר את supernatant ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור. בעדינות להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של בנסנאז חם NACE RPMI 1640. מערבבים את התאים בעדינות, ומסננים אותם באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר, אם כל גושי תאים גלויים.
ספירת תאים ברי קיימא באמצעות כחול טריפן והמוציטומטר. השהו מחדש את מחשבי ה-PBMCs ואת המדיום התרבותי המלא, המכיל 10 יחידות למיליליטר IL2, ו-10 ננוגרם למיליליטר IL7. התאם את צפיפות התאים ל- 1.5x10 ל- 6 תאים למיליליטר.
לאחר מכן צלחת התאים בלוחות התחתונים שטוחים 96-ובכן בצפיפות של 3x10 עד התא החמישי לכל באר. הוסף וירוס הפטיטיס B או בריכות פפטיד נגזר HBV לכל באר. עבור הרקע והשליטה החיובית ולס, הוסף את אותה כמות ממס.
לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום השלישי, להשלים את המדיום התרבותי עם 50 יחידות למיליליטר של IL2, ו 10 ננוגרם למיליליטר של IL7. ביום השביעי, החליפו מחצית מהמדיום התרבותי במדיום טרי המכיל:ארבעה מיקרוגרם למיליליטר פפטידים, 100 יחידות למיליליטר IL2 ו-20 ננוגרם למיליליטר IL7.
ביום העשירי, פינט בעדינות את התאים בכל באר שבע עד תשע פעמים כדי לפזר צבירי תאים מצטברים. ספר את מספר התאים בני קיימא והעבר 2x10 לתאים החמישיים לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96-Well לניתוח תגובת תאי CD4 T ספציפיים של HPV. עבור התאים השיוריים בצלחת התחתונה השטוחה 96-Well, התאם את עוצמת המדיום של התרבות בינונית ל -100 מיקרוליטרים על ידי השלכת מדיום מוגזם.
לאחר מכן, להשלים את התרבות עם 100 microliters של טרי, תרבות מלאה בינוני, המכיל:ארבעה מיקרוגרם למיליליטר פפטידים, 100 יחידות למיליליטר IL2, ans 20 ננוגרם למיליליטר IL7. המשך פולחן התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לזיהוי אפיטופ ביום 12. לשטוף את התאים בצלחת התחתונה העגולה 96-Well על ידי הוספת 200 microliters של RPMI 1640, centrifuging את הצלחת ב 550 פעמים G במשך שלוש דקות, והשלכת supernatant.
יש לחזור על הכביסה פעמיים באמצעות מדיום תרבות מלא לכביסה האחרונה. עבור כל באר של תאים מגורה עם בריכת פפטיד ספציפית, להוסיף 200 microliters של מדיום תרבות מלאה בתוספת אותה בריכת פפטיד. עבור באר בקרת הרקע, הוסף מדיום תרבות מלא, בתוספת מיקרוליטר אחד למיליליטר של DMSO.
עבור באר הבקרה החיובית, להוסיף מדיום תרבות מלא בתוספת מיקרוליטר אחד למיליליטר DMSO, 150 ננוגרם למיליליטר PMA, ומיקרומול אחד לליטר של ionomycin. לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 1.37 מיקרוגרם למיליליטר מונסין לתרבות.
לאחר הדגירה של שש שעות הושלמה, צנטריפוגה את הצלחת ב 550 פעמים G במשך שלוש דקות. הסר את supernatant לשטוף את התאים פעם אחת עם 200 microliters של DPPs, כפי שהוכח בעבר. כתם עבור סמני שטח CD3, CD4 ו- CD8 וסמן כדאיות.
לאחר השעיית התאים עם ויברטור, ולאחר מכן במקרר את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר שטיפת הצלחת פעם אחת עם 200 מיקרוליטרים של DPBS, לתקן ולחלחל לתאים, כתם עבור ציטוקינים תאיים, TNF אלפא ואינטרפרון-גמא, ומקרר את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לשטוף את התאים שוב, ולהשעות אותם מחדש ב 150 microliters של חוצץ cytometry זרימה.
לאחר מכן, לרכוש את נתוני ציטומטריית הזרימה באמצעות cytometer זרימה. לשמור על קווי תאים B-לימפובלסטואידים אלרגניים, או BLCLs, בבקבוק T-75. ביום 12 של הרחבת PBMC, לספור את מספר BLCLs קיימא, ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר.
צנטריפוגות התאים ב 350 פעמים G במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. משעים מחדש את גלולה התא ואת המדיום התרבותי המלא. לאחר מכן, תעתיקו את ה-BLCLs לצלחת תחתונה עגולה של 96-Well ב-4x10 עד התא הרביעי לבאר, ו-80 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי שלם.
הוסיפו 10 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד יחיד, והגדירו שני פקדי רקע. פפטיד פועם עם חסימת HLADR, ופועם DMSO. לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, במשך שעתיים.
מוסיפים 100 מיקרוגרם למיליליטר מיטומיצין C ודגר את הלוח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 200 microliters של RPMI 1640 כדי להסיר פפטיד בלתי מנוצל Mitomycin C, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 120 microliters של מדיום תרבות מלאה, באמצעות ויברטור. ביום ה-12 של הרחבת ה-PBMC, העבר את מחשבי ה-PBMCs לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר.
צנטריפוגות התאים בצלחת, להסיר את supernatant, ולשטוף אותם פעמיים עם 200 microliters של RPMI 1640, כפי שהוכח בעבר. השהה מחדש את מחשבי ה-PBMCs בכל באר עם 210 מיקרו-לייטרים של מדיום תרבות מלא. עבור וולס PBMC שנבחר לזיהוי אפיטופה, aliquot 70 מיקרוליטרים של השעיית התא ומערבבים עם BLCLs פעום פפטיד בשלוש וולס, כולל שני פקדי רקע.
לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 1.37 מיקרוגרם למיליליטר מונסין לתרבות ולהביא את הנפח הסופי בכל באר ל 200 microliters עם מדיום תרבות מלאה. בדוגמה מייצגת זו, TNF אלפא ואינטרפרון-גמא הפרשת CD4 T תגובות תא עבור מאגר פפטיד Core11 נמוכים פי שניים מערכי הרקע, ולכן, נחשב שלילי.
בינתיים, התגובות לבריכת הפפטיד Core09 גבוהות מפי שניים מהדף, ונחשבות חיוביות. הרקע האפור מציין ולס עם תגובה חיובית של תאי CD4 T ופפטידים מועמדים לזיהוי אפיטופ מצוינים באדום, Core01 יש את שיעור התגובה הגבוה ביותר, אם לשפוט על פי תאי CD4T הפרשת TNF אלפא ואינטרפרון-גמא במאגרי פפטיד עמודה. פפטידים C1 עד 15, C31 עד 45, C61 עד 75, ו- C91 עד 105 בבריכת פפטיד זו, מוגדרים כמו פפטידים מועמד כמו שורה של בריכות פפטיד המכיל פפטידים אלה גם להראות תוצאות חיוביות.
מחשבי PBMCs מורחבים עם בריכות פפטיד Core07, 08, 09 ו-10, משמשים לזיהוי אפיטופים של פפטידים אלה. באופן דומה, Core09 יש את שיעור התגובה הגבוה ביותר בבריכות פפטיד שורה. כל הפפטידים בבריכה זו מוגדרים כמו פפטידים מועמדים PBMCs מורחבים עם בריכות פפטיד:Core01, 02, 03, 04, 05 ו 06 משמשים לזיהוי אפיטופה של פפטידים אלה.
עבור מאגר פפטיד Core08 מורחב PBMCs, לאחר גירוי עם פפטיד C31 עד 45 BLCLs פעמו, התדרים של תאי TNF אלפא ואינטרפרון-גמא מפריש CD4 T גבוהים פי שניים מאשר פקדי רקע. לכן, פפטיד C31 עד 45 הוא epitope תא CD4 T מוגבל HLADR מאומת. זה היה שם, מחשבים אישיים מורחבים נוספים שנותרו לאחר זיהוי אפיטופה.
סימון עדין של האפיטופים שזוהו יכול להתבצע באמצעות פאנל של פפטידים מקוצרים.
