In un'infezione cronica da HBV, le cellule T CD4 svolgono un ruolo importante sia nella clearance virale che nei ritorni. Questo metodo ci consente di valutare le risposte specifiche delle cellule T CD4 hbV e identificare gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV, contemporaneamente. A dimostrare la procedura sarà Jianmei Xiao, un assistente di ricerca.
E Xing Wan, un tecnico di Bilao. Per iniziare, isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, dal sangue, utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità Ficoll a 800 volte G per 20 minuti. Quindi, raccogliere i granulociti tra lo strato di globuli rossi e lo strato di globuli rossi, utilizzando una pipetta pasteur.
Trasferire la sospensione cellulare scongelata in un tubo centrifugo da 15 millilitri, aggiungere un millilitro della benzonasi RPMI 1640 preriscaldata, eliminare, quindi aggiungere lentamente altri sei millilitri. Risciacquare il flaconcino crio con due millilitri di benzonasi RPMI 1640 per recuperare le cellule rimanenti. Quindi centrifugare il tubo a 400 volte G per 10 minuti.
Rimuovere il surnatante e allentare il pellet picchiettando il tubo. Sospendere delicatamente il pellet in un millilitro di Bensenase NACE RPMI 1640 caldo. Mescolare delicatamente le cellule e filtrarle attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri, se sono visibili grumi cellulari.
Conta le cellule vitali usando il tripano blu e un emocitometro. Sospendere di sospendere i PBMC e il terreno di coltura completo, contenente 10 unità per millilitro IL2 e 10 nanogrammi per millilitro IL7. Regolare la densità della cella a 1,5x10 alle 6 celle per millilitro.
Quindi placcare le celle in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti ad una densità di 3x10 alle quinte celle per pozzetti. Aggiungere il virus dell'epatite B o i pool di peptidi derivati dall'HBV a ciascun pozzo. Per lo sfondo e i pozzi di controllo positivo, aggiungere la stessa quantità di solvente.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il terzo giorno, integrare il terreno di coltura con 50 unità per millilitro di IL2 e 10 nanogrammi per millilitro di IL7. Il settimo giorno, sostituire metà del terreno di coltura con un terreno fresco contenente: quattro microgrammi per peptidi millilitro, 100 unità per millilitro IL2 e 20 nanogrammi per millilitro IL7.
Il giorno 10, pipettare delicatamente le cellule in ogni pozzo da sette a nove volte per disaggregare i cluster cellulari. Contare il numero di cellule vitali e trasferire 2x10 alle quinte cellule in ciascun pozzetti di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti per l'analisi della risposta delle cellule T CD4 specifiche dell'HPV. Per le celle residue nella piastra a fondo piatto a 96 pozzi, regolare il volume del terreno di coltura a 100 microlitri scartando il mezzo eccessivo.
Quindi, integrare la coltura con 100 microlitri di terreno di coltura fresco e completo, contenente: quattro microgrammi per peptidi millilitro, 100 unità per millilitro IL2, e 20 nanogrammi per millilitro IL7. Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per l'identificazione dell'epitopo il giorno 12. Lavare le celle nella piastra inferiore rotonda a 96 pozzi aggiungendo 200 microlitri di RPMI 1640, centrifugando la piastra a 550 volte G per tre minuti e scartando il surnatante.
Ripetere il lavaggio due volte utilizzando il terreno di coltura completo per l'ultimo lavaggio. Per ogni pozzetti di cellule stimolate con uno specifico pool peptidico, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura completo integrati con lo stesso pool peptidico. Per il controllo in background, aggiungere un terreno di coltura completo, integrato con un microlitro per millilitro di DMSO.
Per il pozzo di controllo positivo, aggiungere un terreno di coltura completo integrato con un microlitro per millilitro DMSO, 150 nanogrammi per millilitro PMA e un micromole per litro di ionomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per sei ore. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 1,37 microgrammi per millilitro di monensin alla coltura.
Al termine dell'incubazione di sei ore, centrifugare la piastra a 550 volte G per tre minuti. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule una volta con 200 microlitri di DPP, come precedentemente dimostrato. Macchia per marcatori di superficie CD3, CD4 e CD8 e un marcatore di vitalità.
Dopo aver sospeso le celle con il vibratore, quindi conservare in frigorifero la piastra a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver lavato la piastra una volta con 200 microlitri di DPBS, fissare e permeabilizzare le cellule, colorare le citochine intracellulari, TNF Alfa e Interferone-gamma e refrigerare la piastra a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Lavare nuovamente le cellule e sospenderle in 150 microlitri di tampone citometrico a flusso.
Quindi, acquisire i dati della citometria a flusso utilizzando un citometro a flusso. Mantenere le linee cellulari allergeniche B-linfoblastoidi, o BRICCL, in un pallone T-75. Il giorno 12 dell'espansione PBMC, contare il numero di LICCL vitali e trasferirli in tubi centrifughi da 15 millilitteri.
Centrifugare le cellule a 350 volte G per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Sospendere di sospendere il pellet cellulare e il terreno di coltura completo. Quindi aliquotare i GLCL a una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti a 4x10 alle quarte cellule per pozzetti e 80 microlitri di terreno di coltura completo.
Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di un singolo peptide e impostare due controlli di sfondo. Peptide pulsante con blocco HLADR e DMSO pulsante. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, per due ore.
Aggiungere 100 microgrammi per millilitro Mitomicina C e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di RPMI 1640 per rimuovere il peptide non spinto e la mitomicina C, quindi sospendere di ripiende le cellule in 120 microlitri di terreno di coltura completo, utilizzando il vibratore. Il giorno 12 dell'espansione PBMC, trasferire i PBMC su una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti.
Centrifugare le celle nella piastra, rimuovere il surnatante e lavarle due volte con 200 microlitri di RPMI 1640, come precedentemente dimostrato. Sospendere di ricandidare i PBMC in ogni pozzo con 210 microlitri di terreno di coltura completo. Per i pozzetti PBMC scelti per l'identificazione dell'epitopo, aliquot 70 microlitri della sospensione cellulare e miscela con GLCL pulsati peptidici in tre pozzi, inclusi due controlli di fondo.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per sei ore. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 1,37 microgrammi per millilitro di monensin alla coltura e portare il volume finale in ciascun pozzo a 200 microlitri con terreno di coltura completo. In questo esempio rappresentativo, le risposte delle cellule T T T secernenti T con TNF Alfa e Interferone-gamma per il pool peptidico Core11 sono inferiori a due volte i valori di fondo, quindi considerati negativi.
Nel frattempo, le risposte per il pool peptidico Core09 sono superiori a due volte lo sfondo e considerate positive. Lo sfondo grigio indica Wells con una risposta positiva delle cellule T CD4 e i peptidi candidati per l'identificazione dell'epitopo sono indicati in rosso, Core01 ha il più alto tasso di risposta, a giudicare sia dalle cellule CD4T secernenti TNF Alfa che da Interferone-gamma in pool peptidici a colonna. I peptidi da C1 a 15, da C31 a 45, da C61 a 75 e da C91 a 105 in questo pool peptidico, sono impostati come peptidi candidati poiché anche la fila di pool peptidici contenenti tali peptidi mostra risultati positivi.
I PBMC espansi con pool peptidici Core07, 08, 09 e 10, sono utilizzati per l'identificazione epitopica di questi peptidi. Allo stesso modo, Core09 ha il più alto tasso di risposta nei pool peptidici di fila. Tutti i peptidi in questo pool sono impostati come peptidi candidati e PBMC espansi con pool peptidici: Core01, 02, 03, 04, 05 e 06 sono utilizzati per l'identificazione epitopica di questi peptidi.
Per i PBMC espansi core08 del pool peptidico, dopo la stimolazione con peptide C31 a 45 GLCL pulsati, le frequenze delle cellule T4 T4 secernenti TNF Alfa e Interferone gamma sono due volte superiori ai controlli di fondo. Pertanto, il peptide da C31 a 45 è un epitopo verificato delle cellule T CD4 con restrizioni HLADR. Era lì, ulteriori PBMC espansi rimanenti dopo l'identificazione dell'epitopo.
La marcatura fine degli epitopi identificati può essere eseguita utilizzando un pannello di peptidi accorciati.
