Em uma infecção crônica pelo HBV, as células CD4 T desempenham papéis importantes tanto na liberação viral quanto nos retornadores. Este método nos permite avaliar as respostas específicas das células CD4 T do HBV e identificar epítopos específicos de células CD4 T do HBV, simultaneamente. Demonstrando o procedimento estará Jianmei Xiao, assistente de pesquisa.
E Xing Wan, um técnico de Bilao. Para começar, isole as células mononucleares periféricas, ou PBMCs, do sangue, usando centrifugação gradiente de densidade ficoll a 800 vezes G por 20 minutos. Em seguida, colete os granulócitos entre a camada de glóbulos vermelhos, usando uma pipeta pasteur.
Transfira a suspensão celular descongelada para um tubo de centrífuga de 15 mililitros, adicione um mililitro do Benzonase RPMI 1640 pré-aquecido, solte em sábio e adicione lentamente mais seis mililitros. Enxágüe o frasco de criote com dois mililitros de Benzonase RPMI 1640 para recuperar as células restantes. Em seguida, centrifugar o tubo a 400 vezes G por 10 minutos.
Remova o supernatante e solte a pelota tocando no tubo. Levemente suspender a pelota em um mililitro de Bensenase NACE RPMI 1640 quente. Misture as células suavemente e filtre-as através de um filtro de células de 70 micrômetros, se algum aglomerado de células estiver visível.
Conte células viáveis usando azul tripano e um hemócito. Suspenda os PBMCs e o meio de cultura completa, contendo 10 unidades por mililitro IL2, e 10 nanogramas por mililitro IL7. Ajuste a densidade celular para 1,5x10 para as 6 células por mililitro.
Em seguida, aplauque as células em 96-Well placas inferiores planas a uma densidade de 3x10 para as quintas células por poço. Adicione o vírus da hepatite B ou as piscinas de peptídeos derivadas do HBV a cada Poço. Para o fundo e controle positivo Wells, adicione a mesma quantidade de solvente.
Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia, suplemente o meio cultural com 50 unidades por mililitro de IL2, e 10 nanogramas por mililitro de IL7. No sétimo dia, substitua metade do meio de cultura por meio fresco contendo:quatro microgramas por peptídeos mililitros, 100 unidades por mililitro IL2 e 20 nanogramas por mililitro IL7.
No dia 10, pipeta suavemente as células em cada Poço sete a nove vezes para desagremar aglomerados celulares. Conte o número de células viáveis e transfira 2x10 para as quintas células em cada Poço de uma placa inferior redonda de 96-Well para análise específica de resposta de células CD4 T do HPV. Para as células residuais na placa inferior plana 96-Well, ajuste o volume do meio de cultura para 100 microliters descartando o meio excessivo.
Em seguida, suplementar a cultura com 100 microliters de meio de cultura fresco e completo, contendo:quatro microgramas por peptídeos mililitros, 100 unidades por mililitro IL2, ans 20 nanogramas por mililitro IL7. Continue a cultura das células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para identificação de epítope no dia 12. Lave as células na placa de fundo redonda 96-Well adicionando 200 microliters de RPMI 1640, centrifugando a placa a 550 vezes G por três minutos, e descartando o supernatante.
Repita a lavagem duas vezes usando meio de cultura completo para a última lavagem. Para cada poço de células estimuladas com uma piscina específica de peptídeos, adicione 200 microliters de cultura completa complementada com a mesma piscina de peptídeos. Para o Poço de Controle de Fundo, adicione meio de cultura completo, complementado com um microliter por mililitro de DMSO.
Para o Poço de Controle Positivo, adicione meio de cultura completa suplementado com um microliter por mililitro DMSO, 150 nanogramas por MILilitro PMA, e um micromole por litro de ionomicina. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por seis horas. Após uma hora de incubação, adicione 1,37 microgramas por mililitro monensina à cultura.
Após a incubação de seis horas ser concluída, centrifugar a placa a 550 vezes G durante três minutos. Remova o sobrenante e lave as células uma vez com 200 microliters de DPPs, como demonstrado anteriormente. Mancha para marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8, e um marcador de viabilidade.
Depois de suspender as células com vibrador, depois refrigerar a placa a quatro graus Celsius por 30 minutos. Depois de lavar a placa uma vez com 200 microlitrais de DPBS, fixe e permeabilize as células, manche para citocinas intracelulares, TNF Alfa e Interferon-gama, e leve à geladeira a quatro graus Celsius por 45 minutos. Lave as células mais uma vez e suspenda-as em 150 microliters de tampão de citometria de fluxo.
Em seguida, adquira os dados de citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo. Mantenha linhas alergênicas de células B-linoblastoid, ou BLCLs, em um frasco T-75. No 12º dia da expansão do PBMC, conte o número de BLCLs viáveis e transfira-os para tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar as células a 350 vezes G por 10 minutos e remover o supernasce. Suspenda a pelota celular e o meio de cultura completa. Em seguida, aliquotar os BLCLs para uma placa de fundo redonda 96-Well em 4x10 para as quatro células por poço, e 80 microliters de meio de cultura completa.
Adicione 10 microgramas por mililitro de um único peptídeo e defina dois controles de fundo. Peptídeo pulsando com bloqueio de HLADR, e pulsação do DMSO. Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, por duas horas.
Adicione 100 microgramas por mililitro Mitomicina C e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Lave a placa três vezes com 200 microliters de RPMI 1640 para remover peptídeos não pulverizados e Mitomicina C, em seguida, suspenda novamente as células em 120 microliters de meio de cultura completa, usando vibrador. No dia 12 da expansão do PBMC, transfira os PBMCs para uma placa de fundo redonda de 96-Well.
Centrifugar as células da placa, remover o sobrenante e lavá-las duas vezes com 200 microliters de RPMI 1640, como demonstrado anteriormente. Suspenda os PBMCs em cada poço com 210 microliters de meio de cultura completa. Para os Poços PBMC escolhidos para identificação de epítope, alíquota de 70 microlitros da suspensão celular e mistura com BLCLs pulsados de peptídeo em três Poços, incluindo dois controles de fundo.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Após uma hora de incubação, adicione 1,37 microgramas por mililitro monensin à cultura e leve o volume final em cada poço a 200 microliters com meio de cultura completa. Neste exemplo representativo, as respostas secretas de células CD4 T do TNF Alpha e Interferon-gamma para o pool de peptídeos Core11 são inferiores a duas vezes os valores de fundo, portanto, consideradas negativas.
Enquanto isso, as respostas para o pool de peptídeos Core09 são maiores do que duas vezes o fundo, e consideradas positivas. O fundo cinza indica wells com uma resposta celular CD4 T positiva e peptídeos candidatos para identificação de epítope são indicados em vermelho, Core01 tem a maior taxa de resposta, a julgar tanto de células TNF Alpha e Interferon-gama secretando CD4T em piscinas de peptídeos de coluna. Peptídeos C1 a 15, C31 a 45, C61 a 75 e C91 a 105 nesta piscina de peptídeos, são definidos como peptídeos candidatos, pois a linha de piscinas de peptídeos contendo esses peptídeos também mostram resultados positivos.
PBMCs expandidos com piscinas de peptídeos Core07, 08, 09 e 10, são utilizados para identificação de epítopes desses peptídeos. Da mesma forma, o Core09 tem a maior taxa de resposta em piscinas de peptídeos de linha. Todos os peptídeos nesta piscina são definidos como peptídeos candidatos e PBMCs expandidos com piscinas de peptídeos:Core01, 02, 03, 04, 05 e 06 são usados para identificação de epítope desses peptídeos.
Para o pool de peptídeos Core08 expandiu pbmcs, após estimulação com peptídeo C31 a 45 BLCLs pulsados, as frequências de células CD4 T t de TNF e interferon-gama são duas vezes maiores do que os controles de fundo. Assim, o peptídeo C31 a 45 é um epítope de célula CD4 T restrito hladr verificado. Foi lá, outros PBMCs expandidos permanecendo após a identificação do epítope.
A marcação fina dos epítopos identificados pode ser realizada utilizando um painel de peptídeos encurtados.
