Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о интегральных мембранных белках, таких как олигомерное состояние, их размер, общая форма и структура низкого разрешения в растворе. Решение исследований мембранных белков требует стабилизации молекул, таких как моющие средства. Этот метод имеет то преимущество, что он делает моющие средства невидимыми и подчеркивает сигнал от мембранного белка.
Последствия этого метода распространяются на многие биологические и медицинские исследования вопросы, потому что более 1 / 3 белков находятся в мембранах, где они выполняют многие жизненно важные клеточные функции. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку дейтерия маркировки и нейтронного рассеяния шаги трудно узнать, потому что очень немногие учреждения предлагают обучение в этих методах. Для начала определите плотность длины рассеяния нейтронов или SLD с помощью веб-приложения MULCh, модулей для анализа данных контрастных вариаций.
Откройте контрастный модуль, нажав контраст, расположенный в левом навигационном стекле. Предоставьте текст для названия проекта и введите подробную информацию ниже для двух компонентов в качестве подразделения один и подразделение два. Введите молекулярную формулу для каждого компонента в текстовом поле формулы.
Затем введите объем в кубических ангстремах для каждого компонента в коробке ниже объема. Наконец, введите сведения о компонентах буфера. Нажмите представить для выполнения нейтронных контрастных расчетов.
Создается страница результатов, которая обеспечивает таблицу плотности длины рассеяния и точек контрастного матча, а также формулы для определения этих параметров в любом данном проценте D2O в буфере. Просмотрите параметры рассеяния с особым вниманием к точкам контрастности компонентов. Выращивай клетки E.coli, укрывая неизгладимый вектор экспрессии для последовательности целевого белка в среде LB до оптической плотности в 600 нанометров или OD 600 примерно одного.
Адаптация клеток E.coli к дейтерия помечены среды до масштабирования для чрезмерного выражения дейтератированного белка путем разбавления культуры LB от одного до 20 в трех миллилитров минимальной среды. После роста до OD 600 примерно одного, повторите от одного до 20 разбавлений, используя минимальную среду, содержащую 50, 75 и 100%D2O. После адаптации, продолжать расти культуры в биореактор для увеличения урожайности дейтетерированной массы клеток.
По мере увеличения содержания D2O темпы роста будут снижаться. Приступайте к сбору, облысе и очистке клеток, как описано в текстовом протоколе. Далее equilibrate столбец исключения размера с более чем двумя томами столбца окончательного буфера обмена с помощью быстрой белковой жидкой хроматографии системы.
После введения образца запустите столбец в изоляционных фракциях, соответствующих интересного белка. Зарезервировать aliquot соответствует буфер для небольшого угла рассеяния нейтронов или SANS фон вычитания. Для сбора данных SANS сначала загрузите образцы и буферы в кварцевые ячейки.
После обеспечения того, чтобы затвор луча был закрыт, подойди к области среды образца и поместите кварцевые ячейки в смену образца. Завехать положение смены выборки для каждой ячейки образца. Проверьте область и убедитесь, что луч путь свободен от препятствий, прежде чем покинуть область окружающей среды образца.
Затем откройте затвор луча. Выполните сканирование таблицы для автоматического сбора данных. Следуйте инструкциям по эксплуатации приборов, предоставленным ученым по рассеянию нейтронов.
Используйте программное обеспечение Mantid Plot и скрипт Python для уменьшения данных SANS с 2D-изображения до 1D-сюжета. Для этого войдите в кластер удаленного анализа и выполните сюжет Mantid из командной строки. Затем откройте предоставленный скрипт сокращения пользователей и поместите соответствующие номера сканирования или идентификацию для образца в буферные пары в соответствующем списке.
Выполните скрипт для генерации уменьшенных данных в качестве текстового файла с четырьмя столбецами в указанном месте. Право нажмите соответствующее рабочее пространство и mantid участок и выбрать участок с ошибками для первоначального изучения рассеяния профилей. Загрузите набор программного обеспечения ATSAS и используйте PRIMUS для построения данных, масштабирования буфера и вычитания и анализа Guinier.
Запустите приложение ATSAS, SAS для анализа данных и загрузите уменьшенные файлы данных, соответствующие выборке и буферной паре. Чтобы правильно масштабировать буфер, выберите диапазон данных на высоком уровне, где оба профиля похожи по квартире, и нажмите кнопку масштаба, расположенную под вкладкой операций. Увеличьте диапазон данных, чтобы просмотреть все точки, нажмите вычесть для выполнения этой операции.
Выполните анализ данных буфера, вычитаемого из буфера, используя вкладку анализа приложения анализа данных SAS. Убедитесь, что правильный файл выбран в списке и нажмите радиус gyration. Автоматизированная попытка выполнить подгонку Guinier будет предоставлена, нажав на кнопку auto RG.
Расширьте диапазон данных, используемых для включения всех данных с низким уровнем качества, и начните сужать диапазон данных, забирая высокие точки до тех пор, пока максимальная точка RG не будет ниже 1,3. Используйте участок остатков, чтобы убедиться, что данные являются линейными в нужном диапазоне. Внесите небольшие коррективы в подходящий регион и отслеживаем чувствительность этих значений к диапазону данных, используемых в пригонках.
Получить функцию распределения вероятности P R в гноме. Теперь запустите мастер распределения расстояния в вкладке анализа. Получение хорошей подгонки к данным имеет важное значение для получения качественной модели.
Определите Dmax, максимальное межатомное расстояние внутри молекулы. Оцените значение для Dmax, контролируя коробку, чтобы заставить Rmax равен нулю и ввод большого значения для Dmax. Первый X перехват в участке P R дает эту оценку.
Внести дополнительные изменения в это значение Dmax, а также диапазон данных, используемых для количества точек, используемых для оптимизации гнома подходят к данным и в результате P кривой R. Запустите мастер формы PRIMUS с кнопки dammif на вкладке анализа анализа данных SAS и используйте ручной выбор параметров. Определите диапазон Guinier от подгонки и перейти к следующему шагу с помощью кнопок навигации.
Определите значения подгонки из участка P of R и перейти к следующему шагу. Предоставьте параметры процесса моделирования ab initio. Затем инициируют процесс с помощью кнопки коммит.
Наложение и наложение окончательного без конверта с связанной моделью высокого разрешения с использованием supcomb в ATSAS. Поместите копию модели PDB высокого разрешения, чтобы соответствовать конверту SANS в рабочем каталоге. Затем выполните supcomb из командной строки, используя имена файлов PDB в качестве двух аргументов со структурой шаблона, перечисленной в первую очередь.
Наконец визуализировать ab initio результаты модели с помощью PyMOL, 3D молекулярной графики просмотра программы. После того, как оболочка SANS и структура высокого разрешения были наложены, эти модели могут быть визуализированы с помощью любой программы просмотра молекулярной графики. Отображается обзор процесса визуализации PyMOL.
После того, как файлы структуры PDB были открыты в PyMOL, модели должны быть видны в окне просмотра PyMOL. Представления каждой модели могут быть изменены с помощью кнопки S рядом с каждым именем файла. Здесь для оболочки SANS используется представление поверхности, а для белковой основы модели с высоким разрешением используется мультяшное представление.
Подходящая цветовая гамма может быть выбрана из опций, доступных под кнопкой C. Для белковых цепей, цепная окраска обеспечивает градиент цвета от N до C терминуса, чтобы помочь интерпретации. Прозрачность применяется к представлению поверхности, чтобы лучше визуализировать структуру белка в оболочке.
Для публикации изображений рекомендуется белый фон. После того, как эти сигналы визуализации были применены 3D структуры могут быть рассмотрены путем нажатия и перетаскивания структуры. Манипуляции перспективы и вращения молекулы и перевода могут быть выполнены.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы точно соответствовать нейтронный контраст моющего средства головы и хвоста групп с D2O H2O растворителя. После своего развития, эта техника проложила путь для изучения структуры внутримембранных аспарто proteases. Эти белки участвуют в иммунном ответе, гепатите С и болезни Альцгеймера.
Не забывайте, что работа в биохимических лабораториях и на объектах нейтронных лучей может быть опасной. Меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и следование всем правилам безопасности объекта и радиологические проводки, являются обязательными при выполнении этой процедуры.
