Митохондрии в значительной степени полагаются на ядерный геном, несмотря на наличие собственной ДНК. Таким образом, требуется жестко регулируемый механизм импорта. Этот метод помогает изучить процесс и то, как он может адаптироваться к внешним раздражителям.
Это единственный биохимический метод, доступный для количественной оценки импорта белка в различные субкомпоненты митохондрий. Жизнеспособность митохондрий связана с различными болезненными состояниями, поэтому понимание того, как регулируется импорт белка, может помочь внести свой вклад в новые терапевтические подходы, нацеленные на митохондрии. Дополнительный уход требуется во время изоляции, чтобы обеспечить жизнеспособность и целостность митохондрий.
Необходимо тщательное измельчение ткани и аккуратное повторное использование всех последующих гранул. Продемонстрировать процедуру будет Эшли Оливейра, аспирант в моей лаборатории. Чтобы начать выделение митохондрий из скелетных мышц, удалите жир и соединительную ткань из мышц и измельчите ткани на предварительно охлажденном часовом стекле, пока оно не станет однородной суспензией.
Поместите измельченную ткань в предварительно охлажденную 50-миллилитровую пластиковую центрифугированную трубку и запишите точный вес. Затем разбавляют измельченную ткань десятикратно буфером 1, содержащим АТФ. Используйте восьмимиллиметровый двухлопастной гомогенизатор для гомогенизации мышечного образца при выходной мощности 9,8 Гц в течение 10 секунд, гарантируя, что не останется видимых кусков мышц.
После вращения образца при 9 000x G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия тщательно повторно суспендируйте гранулу примерно в 95 микролитах среды для повторного суспензии. Центрифугируйте образец перед выбросом супернатанта и аккуратно повторно суспендируйте гранулу примерно 180 микролитрами ресуспенсационной среды с помощью пипетки P-200. Для перевода in vitro подготовьте достаточно реакционной смеси для трансляции, чтобы подать 20 микролитров на образец митохондрий для использования в импортном эксперименте и для трансляционной полосы.
Поместите реакцию для инкубации при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 15 минут после начала реакции трансляции аликотируют 90 мкг митохондрий в стерильные 1,5-миллилитровые трубки и предварительно инкубируют при 30 градусах Цельсия в течение 10 минут. В свежем наборе стерильных 1,5-миллилитровых пробирок соедините 75 мкг митохондрий с 18 микролитрами трансляционной реакции и инкубируйте трубку при 30 градусах Цельсия в течение нужного времени.
Оставшийся объем реакции перевода держите на льду. Чтобы прекратить реакцию импорта после соответствующего времени инкубации, снимите трубку с температуры 30 градусов Цельсия, чтобы поместить ее на лед, а затем осторожно перенесите реакцию импорта поверх трубки с подушкой сахарозы. Центрифугируйте образцы сахарозной подушкой при 17 000x G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Используя пипетку P-1000, осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу. Для ввоза во внешнюю мембрану проводят реакцию, используя Tom40, и повторно суспендируют гранулу в 50 микролитрах свежеприготовленного 0,1-молярного карбоната натрия, и инкубируют на льду в течение 30 минут. После инкубации центрифугируйте образец при 14 000x G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Затем подготовьте образцы для электрофореза SDS-PAGE, как описано в рукописи. Подготовьте контрольную полосу трансляции путем смешивания трех микролитров оставшейся реакции трансляции с 37 микролитрами буфера лизиса и пятью микролитрами образца красителя. Кипятите образцы в течение пяти минут при 95 градусах Цельсия и осторожно вращайте вниз на низкой скорости, чтобы избежать гранулирования митохондрий.
После нанесения образцов на полиакриламидный гель SDS вскипятите гель в 5%-ной трихлоруксусной кислоте, или TCA, в вытяжном шкафу в течение пяти минут с непрерывным перемешиванием. Затем поместите гель в двойную дистиллированную воду на вращающуюся пластину на одну минуту со скоростью 50 оборотов в минуту. Промыть гель в 10-миллимоляре Трис на вращающейся пластине в течение пяти минут со скоростью 50 оборотов в минуту.
Чтобы вывести белок в осадок, промыть гель в достаточном объеме одномолярной салициновой кислоты, чтобы покрыть гель на вращающейся пластине в течение 30 минут. Чтобы обезвоживать гель, поместите большой лист промокательной бумаги на пористую поверхность гелевой сушилки и один лист бумажного полотенца в область, где будет наноситься гель. Затем вырежьте 11 сантиметров на 9 сантиметров лист промокательной бумаги и поместите бумагу на бумажное полотенце.
Используйте второй кусок бумаги размером 11 сантиметров на 9 сантиметров, чтобы вычерпать гель из контейнера и положить гель вниз поверх первого кусочка. Положите немного больший кусок пластика на гель, чтобы не было складок или пузырьков под оболочкой. Затем положите пластиковую крышку гелевой сушилки поверх упаковки.
Включите пылесос. Убедитесь, что пластиковая крышка сформировала уплотнение, подняв угол пластиковой крышки и дождавшись, пока крышка вновь запечатается. Закройте гелевую сушилку, чтобы она работала в течение 90 минут, начиная с 30 градусов по Цельсию, чтобы постепенно достичь 80 градусов по Цельсию, и вернитесь к 30 градусам Цельсия в конце пробега.
Заверните гель в полиэтиленовую пленку, используемую в процессе сушки. После обезвоживания гель затвердеет и почувствует себя тонким. Поместите обезвоженный гель в кассету с фосфорной пленкой сверху.
Экспонируйте пленку в течение 24 часов, прежде чем визуализировать гель с помощью авторедиографии с любым подходящим тепловизором, который способен к фосфорной визуализации. Репрезентативный анализ показывает нормальные темпы импорта малатдегидрогеназы, или MDH, в субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондриях и продукт трансляции предшественника MDH. Добавление валиномицина ингибировало импорт белка MDH в матрицу митохондрий SS и IMF.
Аналогичным образом, моющее средство Triton X ингибировало импорт MDH в обе субфракции из-за солюбилизации внутренней мембраны. Оценка импорта белка проводилась в течение все большей продолжительности времени, и последующие данные показали, что импорт является процессом, зависящим от времени, а митохондрии SS и IMF имеют разные темпы или возможности для импорта. Когда крыс подвергали электрической стимуляции, импорт Tom 40 во внешнюю мембрану был выше в мышцах у хронически стимулированных животных по сравнению с контрольной группой.
Орнитин транскарбамилаза, или импорт ОКТ, в митохондриальный матрикс увеличивался в каждой точке инкубации, что приводило к 1,4-кратному увеличению митохондрий из хронически стимулированных мышц. Импорт белка положительно коррелировал с индексом содержания митохондрий и оценивался по активности ЦОГ. При исследовании митохондриально-опосредованного апоптоза животные Бакса и Бака с двойным нокаутом продемонстрировали снижение импорта белка в митохондриальный матрикс.
Шесть недель добровольной работы колес спасли дефект импорта у животных с двойным нокаутом. Важно учитывать такие переменные, как продолжительность реакции импорта и какой белок должен быть импортирован. Цитозольные фракции могут быть включены в реакцию, чтобы понять, как цитозольные факторы могут влиять на скорость импорта.
Альтернативно, белки могут быть модифицированы перед инкубацией, чтобы понять, как белки могут быть селективно импортированы. Этот метод может помочь в понимании сложной этиологии митохондриальных миопатий, которые могут присутствовать в различных болезненных состояниях.
