Протокол FASP представляет 17000 подход к протеомии мочевыводящих путей из-за его совместимости с сильно денатурированными буферами и из-за его способности сконцентрировать образец на фильтре, который имеет решающее значение для разбавленных образцов белка. Протокол FASP в сочетании с данными независимого анализа масс-спектрометрии позволяет нам достичь глубокого охвата протеомом в EPS-моча, которая мочи, собранной после цифрового ректального экзамена. В настоящее время мы применяем метод, который вы собираетесь увидеть в усилиях по открытию биомаркеров на рак простаты.
Процедуру покажут Лисия Престагиакомо, Паола Морелли и Катерина Габриэле. Центрифуга EPS-мочи образцов в течение двух часов после сбора в течение 10 минут при 2, 100 RCF при комнатной температуре. Затем храните супернатанты при температуре минус 80 градусов по Цельсию до их использования.
Бросьте образцы на лед, или при четырех градусах. Чтобы ускорить процедуру, можно перенести образцы с минус 80 до минус 20 за день до пищеварения. В качестве фондовых решений, вам понадобится 500 миллимоляров DTT, 10%SDS, один буфер molar Tris при рН восемь.
Разбавить 500 микролитров каждого образца ЭПС-мочи 67 микролитров SDS, 67 микролитров DTT и 33 микролитров буфера Tris. Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут с нежной тряской. Соберите центробежный фильтр с отрезанным молекулярным весом 10 000 Далтонов.
Затем добавьте в фильтр 300 микролитров разбавленного образца ЭПС-мочи. Центрифуга при 14 000 г в течение примерно 20 минут. Вы можете временно прервать процедуру примерно через 15 минут, чтобы проверить, идет ли фильтрация гладко.
Продолжайте до тех пор, пока все решение не будет пройдено через фильтр. Затем добавьте 200 микролитров буфера мочевины и центрифуги при 14 000 г в течение 15 минут. Повторите этот шаг во второй раз.
Когда поток через вот-вот коснется фильтра, опорожните коллекцию Eppendorf путем трубопроводов из потока через. Белки безопасны на фильтре. Для алкиляции цистеин, подготовить раствор иодоацетамида непосредственно перед использованием.
Взвесите около 10 миллиграммов иодоацетамида в ряде флаконов Эппендорфа и растворите его в буфере мочевины при концентрации 9,25 миллиграмма на мл, или в терминах моларности, 50 миллимоляров. Добавьте 50 микролитров раствора иодоацетамида к каждому фильтру и центрифуге при 6000 г в течение 25 минут. Более низкая скорость центрифугации позволит фильтрам не иссякнуть.
После алкиляции белка промойте фильтры двумя последовательными 200 микролитерными алицитами буфера мочевины и центрифуги при 14 000 г в течение 20 минут. Отбросьте поток через. Добавьте 200 микролитров 50 миллимоляров три этилового аммония бикарбоната буфера и центрифуги на 14000 г в течение 20 минут.
Повторите этот шаг. После полного завершения последней стирки бикарбоната, перенесите блок фильтра в новую трубку сбора. Затем добавьте 60 микролитров буфера 50 миллимолярной TEAB.
Добавьте один микролитер трипсинового раствора при концентрации 200 нанограмм на микролитер трипсина. Кроме того, вы можете подготовить буфер пищеварения для всех образцов в флаконе Eppendorf и распределить 61 микролитров буфера пищеварения для каждого фильтра. Если вы используете ThermoMixer, чтобы избежать испарения образца во время ночной инкубации, оберните каждый фильтр единицы с слоем алюминиевой фольги, а затем слой парафильма.
Инкубировать образцы при 37 градусах за ночь. На следующее утро перенесите фильтры на скамейку верхней центрифуги для очень короткого спина. После вращения откройте крышки Эппендорфа и добавьте 140 микролитров воды.
Центрифуга флаконов на 14000 г в течение 25 минут, для того, чтобы собрать пептиды. Собранный объем должен быть около 190 микролитров. Для того, чтобы удалить следы SDS из дайджеста, сильная очистка обмена катиоцией пептидов до LC-MS-MS рекомендуется.
Подготовьте держатели микроколумна, пронзая крышки Eppendorf острым инструментом, как пинцет или ножницы. Держатель будет вмещать микроколумна во время центрифугации. Так как они утомительно готовить, держатели могут быть использованы несколько раз.
Используя тупой и иглы, удалить налет соответствующего диска извлечения. Диски извлечения – это мягкие полимерные материалы, содержащие сорбентные частицы. В этом случае сорбент состоит из частиц с сильными свойствами обмена катицией.
Разместите налет в 200 микролитровый наконечник пипетки. Использование поршня нажмите вилку к концу кончика. Маленький диск следует толкать твердо, но избегая чрезмерной прочности.
Вставьте наконечник в держатель и соберите спин микроколумен с помощью двух миллилитров Эппендорф флакон, из которого оригинальная крышка была удалена. Вилка из иглы калибра 16 будет иметь грузоподъемность около пяти микрограммов пептидов. Состояние микроколумна с двумя последовательными моет.
Соответствующая скорость будет зависеть от того, насколько сильно вы толкаете диск в кончик пипетки. Цель достижения текти в порядке от 20 до 30 микролитров в минуту. Старайтесь не сушить кончик во время стирки и во время загрузки образца.
Разбавить образец пять раз в мытье раствор два и загрузить результаты в растворе на более медленной скорости. Цель для потока около 15 до 20 микролитров в минуту. При необходимости отбросьте поток через него.
Смойте остаточные моющие средства. Затем дайте диску высохнуть перед пептидной элюционией. Перенесите микроколумн в чистую трубку 1.5 Eppendorf и немедленно добавьте элюент.
Который будет семь микролитров 500 миллимолярный ацетат раствор ацетата аммония, содержащий 20%ацетонитрил. Разбавить элуат 27 микролитров 0,1% формовой кислоты, чтобы снизить процент органического растворителя, а затем ввести два микролитров в результате решения в LC-MS-MS с обнаружением в режиме зависимости от данных. Подробная информация о настройке LC-MS, используемая в этом протоколе, будет предоставлена позже в видео.
После выполнения поиска базы данных и интеграции пептидных ошибок вычислите общую область пика. Затем сравните его с внешней стандартной кривой для оценки концентрации пептида в дайджесте FASP. После оценки количества пептида очистите новый алицита дайджеста FASP, соответствующего двум микрограммам пептидов, двумя последовательными очистителями StageTip, описанными здесь.
Установка LC-MS, используемая в этом протоколе, основана на прямом впрыске в аналитическую колонку. Если вы используете систему с столбец захвата, вы можете избежать шага автономной очистки C18. Не забудьте использовать специальные иглы и поршни для каждого хроматографического материала.
После eluting пептиды из C18 Этап Совет с 10 микролитров элюента, частично испаряются элуат в вакуумной центрифуге в течение нескольких минут, стараясь избежать полного испарения. Затем добавьте 47 микролитров 0,1% кремовой кислоты и поместите полученный раствор в флакон HPLC для анализа LC-MS. Используемая здесь система основана на прямой загрузке образца столбца без использования столбца захвата.
Аналитические колонки в доме сделаны, потянув 75 микрометровый идентификатор капилляра после удаления кусок полиамидного покрытия. Полученный наконечник можно аккуратно формировать керамическим резаком. Капилляр помещается в упаковочную бомбу и упаковывается с 50 миллиграмм на мл изопропанола суспензии C18 три микрометров стационарных частиц фазы.
Необходимо давление газа от 10 до 20 слитков азота или гелия. Можно использовать альтернативные или коммерческие колонки хроматографии, работающие на субминере в минуту. Соберите столбец на T-кусок.
Два других конца соединены с высоковольтным источником питания и петлей HPLC. Оцените оптимальное напряжение брызг, запуская систему при изократическом потоке. Затем начните анализ.
Разделив пептиды в течение двух часов хроматографического градиента, как показано на основе. Получение данных будет состоять из быстрого полного сканирования службы MS с последующим 26 MS-MS сканирование на окнах-предшественниках переменной ширины. Начиная с ширины 20 м/з, для первых 20 окон, которые будут охватывать м / з диапазоне от 350 до 750 Томпсон.
Затем переход на ширину 50 м/з для следующих пяти окон и заканчивая одним сканированием MS-MS, имеющих ширину изоляции 200 Томпсон. Более узкие ширины составляют более населенную область спектра с точки зрения наличия прекурсоров пептида. Для анализа DIA вам понадобится спектральная библиотека.
Для создания спектральной библиотеки можно провести несколько экспериментов, зависящих от данных, на той же системе LC-MS-MS, которую вы использовали для приобретения DIA, используя тот же градиент хроматографии. Фракция выборки увеличит охват протеомомами. Советы по этапу могут быть использованы для фракционования образцов.
Сильный обмен катицией и базовая обратная фаза являются двумя действительными альтернативами. Начните с 10 микрограммов пула из нескольких дайджестов FASP. Подкисляйте образец, используя 0,2%TFA конечной концентрации.
Загрузите пептиды на высокой емкости C18 Этап Советы. Используйте несколько дисков в случае высоких пептидных количеств. Для 10 микрограммов материала рекомендуется два диска.
Выполните очистку C18, как описано ранее. Приготовьте несколько флаконов для коллекции eluate. Столько же, сколько и количество фракций.
В этом случае 10 фракций производятся пошаговому элюции. После последней стирки добавьте 20 микролитров первого элюента. 0,2%аммоний гидроксид, 10 миллимолярия TEAB, 4%ацетонитрил.
После полного eluting первой фракции в первом Eppendorf, переместить этап Совет к следующей коллекции флакон. Разбавить в 20 шагов микролитера, используя в качестве элюента, 0,2% гидроксида аммония, 10 миллимолярный TEAB, а затем увеличивая количество ацетонитрила. После фракционирование выборки и работать данные зависимых экспериментов на каждой фракции, генерировать спектральной библиотеки путем поиска базы данных MS-MS данных.
Библиотека будет затем импортироваться в программное обеспечение, способное анализа данных DIA для количественной оценки белка на основе как минимум одного уникального пептида, назначенного минимум тремя переходами. Ожидайте, чтобы покрыть широкий спектр мочевыводящих протеом. Эта цифра показывает идентификацию и количественную оценку белков в диапазоне изобилия, охватывающих пять порядков величины.
Представленный здесь рабочий процесс сочетает в себе преимущество концентрации и универсальность протокола FASP с чувствительностью режима сканирования DIA. Эта комбинация обеспечивает богатую карту мочевыводящих протеом. Поскольку наша настройка анализа не включает в себя использование столбца захвата, дайджест FASP был очищен как сильным обменом катиоций, так и обратными фазами Stage Tips.
Обратный этап Этап Советы шаг может быть опущен, когда захват столбец подключен непосредственно к аналитической колонке. Использование этого рабочего процесса рекомендуется для анализа образцов ЭПС-мочи, но его использование может быть распространено на протеомику мочевыводящих путей в целом.
