Этот протокол важен, потому что он позволяет визуализировать не только то, может ли последовательность усилителя управлять экспрессией, но и то, где она может управлять экспрессией в определенной части тела. Это быстро. Инъекции занимают менее 10 минут, а экспрессируется ли и где экспрессируется ген репортера, можно увидеть всего за несколько дней после сбора образца.
Чтобы начать клонирование, выберите или спроектируйте конструкцию репортера. Конструкция, используемая здесь, помещает кандидата на энхансер в три основные непереведенные области репортерского гена EGFP, экспрессируемого под контролем минимального промотора hsp68. Чтобы спроектировать праймеры ПЦР для усиления интересующей последовательности и клонирования в вектор, добавьте соответствующий гомологический рычаг для клонирования Гибсона к пяти основным концам праймеров.
Используя разработанные праймеры, выполните ПЦР из образца ДНК. Переваривайте от одного до 10 микрограммов векторной ДНК с помощью Pac1 и Asc1, в зависимости от желаемого количества необходимых реакций клонирования. Используя электрофорез от 0,7 до 1% геля в течение 30-60 минут при 100 вольтах, отделите фрагменты рестрикции переваривания.
Извлеките полосу для линеаризованного вектора и очистите ее с помощью коммерческого набора для экстракции геля. Как только клонирование Гибсона и трансформация клеток завершены, помечайте клетки на селективные среды и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. После проверки успешного клонирования конструкции репортера привите пять миллилитров закваски с использованием глицеринового запаса.
Выращивайте культуру в течение восьми-16 часов в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Когда бульон станет мутным, разбавьте заквасочную культуру в 1000 раз в 250-300 миллилитрах свежего селективного бульона LB и высиживайте его на ночь в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Используя коммерческий плазмидный макси-набор, очистите плазмиду.
Чтобы проверить рекомбинацию ITR, выполните переваривание Xma1. Визуализируйте полосы. Убедитесь, что ваш дайджест показывает ожидаемое количество полос.
Рекомбинация приведет к меньшему количеству полос, чем ожидалось. Готовят к поставке рекомбинантную смесь ААВ. При сравнении паттернов экспрессии нескольких вирусов-репортеров энхансеров разбавьте каждый вирус, чтобы приравнять титры вируса к наименее концентрированному вирусу.
Смешайте энхансерный репортерный вирус и конститутивно экспрессируемый контрольный репортерный вирус в соотношении два к одному или три к одному. Добавьте небольшое количество быстрого зеленого красителя с конечной концентрацией 0,06% Разбейте кончик вытянутой стеклянной пипетки, изготовленной из капиллярной трубки с микролитровой градуировкой, аккуратно проткнув ее в нежную, безворсовую салфетку. Вставьте пипетку в аспираторный узел с помощью устройства для подачи давления, соединенного с резиновой прокладкой для удержания микрокапиллярной пипетки.
Втяните небольшой объем от 0,2 до 0,5 микролитра минерального масла в пипетку, применяя отрицательное давление через аспиратор. Держите аспиратор в стороне и поместите вирус на лед, пока он не будет готов к инъекции. После криоанестезирования неонатальных мышей примените отрицательное давление с помощью аспиратора в сборе и втяните вирусную смесь в вытянутую стеклянную пипетку, пока мениск не пройдет отметку в два микролитра.
Выньте мышь из холодной камеры и поместите ее на столешницу. Найдите места двусторонней инъекции на полпути между лямбдой и брегмой, а также сагиттальный шов и каждый глаз. Продезинфицируйте их с помощью спиртовой салфетки.
Проткните череп неонатальных мышей с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Когда игла входит в череп, приложите положительное давление через аспираторный узел. Распределите один микролитр вируса в боковой желудочек и извлеките пипетку.
Поместите мышь на грелку или согревающую камеру для восстановления. Верните животное в домашнюю клетку после пробуждения. Записывайте флуоресцентные изображения, проходящие через участок мозга, используя 5-кратную субъективную линзу с низким увеличением.
Определив место инъекции, оцените степень трансдукции вируса в зависимости от плотности и интенсивности красных флуоресцентных клеток. Сравните животных, которые были трансдуцированы аналогичным образом. Записывайте флуоресцентные изображения с объективом с более высоким увеличением более чем в 25 раз.
Затем откройте программное обеспечение для анализа и примените медианный фильтр «три на три» для снижения шума. Нажмите на меню «Процесс», затем нажмите «Шум» и выберите опцию «Деспекл». Далее, чтобы вычесть фоновую флуоресценцию из изображений, начните с разделения каналов многоканального изображения.
Нажмите на меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите опцию «Разделить каналы». С помощью инструмента выделения «Прямоугольник» или «Круг» нарисуйте небольшую фигуру в области изображения без флуоресцентных ячеек. Измерьте среднюю интенсивность пикселей фона, щелкнув «Анализировать», а затем «Измерить», и повторите выборку несколько раз.
Усредните среднее значение серого цвета от пяти до восьми фоновых областей и удалите десятичные значения. Вычтите значения из каждого пикселя изображения, выбрав меню «Процесс», затем выберите «Математика и вычитание». Затем введите фоновое значение для вычитания и нажмите кнопку ОК. При необходимости объедините каналы обратно в многоканальное изображение, выбрав меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите «Объединить каналы».
Чтобы подсчитать количество зеленых флуоресцентных клеток, скройте зеленый канал и нарисуйте форму вокруг области мозга, выражающую красную флуоресценцию, с помощью инструмента выделения свободной формы. Нажмите на функцию Измерить, чтобы измерить площадь, интегрированную плотность и среднее значение серого красного канала в выбранной зоне. Подсчитайте количество зеленых ячеек с помощью инструмента многоточечного выделения и нормализуйте количество зеленых ячеек по интегральной интенсивности красного канала.
После трансдукции репортера энхансера, который мышь вводила интракрационно в P0 с положительной конструкцией AAV, показал экспрессию EGFP, управляемую энхансером, в средних нижних слоях коры через 28 дней после инъекции. Мышь, которой вводили отрицательную контрольную конструкцию при P0, не показывает никакой экспрессии EGFP через 28 дней после инъекции, демонстрируя, что энхансерные элементы управляют транскрипцией EGFP в мозге мыши. Для визуализации успешно трансдуцированной области и контроля потенциальной изменчивости были исследованы библиотеки репортеров усилителей AAV различных титров.
Библиотека усилителей-кандидатов с высоким титром обеспечивает широкую экспрессию EGFP, в то время как библиотека усилителей-кандидатов с более низким титром стимулирует разреженную экспрессию CGFP в мозге мыши P7. Очень важно смешивать репортер энхансера AAV с положительным контролем при каждой инъекции, чтобы различать энхансеры без активности и неудачные роды. Эта процедура может быть сопряжена с иммуногистохимией, РНК FISH или секвенированием одноклеточной РНК, чтобы определить, в каких типах клеток активен энхансер.
