Questo protocollo è significativo perché consente di visualizzare non solo se una sequenza enhancer può guidare l'espressione, ma dove può guidare l'espressione in una particolare parte del corpo. È veloce. Le iniezioni richiedono meno di 10 minuti per essere completate e se e dove viene espresso un gene reporter può essere visto entro pochi giorni dalla raccolta del campione.
Per iniziare la clonazione, scegliere o progettare un costrutto reporter. Il costrutto utilizzato qui colloca il candidato enhancer nelle tre regioni principali non tradotte di un gene reporter EGFP espresso sotto il controllo del promotore minimo hsp68. Per progettare i primer PCR per amplificare una sequenza di interesse e clonazione nel vettore, aggiungere il braccio di omologia appropriato per la clonazione di Gibson alle cinque estremità prime dei primer.
Utilizzando i primer progettati, eseguire la PCR da un campione di DNA. Digerire da uno a 10 microgrammi di DNA vettoriale usando Pac1 e Asc1, a seconda del numero desiderato di reazioni di clonazione richieste. Impiegando elettroforesi su gel dallo 0,7 all'1% per 30-60 minuti a 100 volt, separare i frammenti di digestione di restrizione.
Estrarre la banda per il vettore linearizzato e purificarla con un kit di estrazione gel commerciale. Una volta completata la clonazione di Gibson e la trasformazione delle cellule, placcare le cellule su terreni selettivi e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver verificato la riuscita clonazione del costrutto reporter, inoculare cinque millilitri della coltura starter utilizzando lo stock di glicerolo.
Coltiva la coltura da otto a 16 ore in un'incubatrice vibrante a 30 gradi Celsius e 180 rotazioni al minuto. Quando il brodo diventa torbido, diluire la coltura starter 1.000x in 250-300 millilitri di brodo LB fresco selettivo e incubarlo durante la notte in un'incubatrice vibrante a 30 gradi Celsius e 180 rotazioni al minuto. Utilizzando un maxi kit plasmidico commerciale, purificare il plasmide.
Per testare la ricombinazione degli ITR, eseguire una digestione Xma1. Visualizza le bande. Assicurati che il tuo digest mostri il numero previsto di bande.
La ricombinazione si tradurrà in un numero inferiore di bande rispetto al previsto. Preparare la miscela AAV ricombinante per la consegna. Se si confrontano i modelli di espressione di più virus enhancer reporter, diluire ciascun virus per equiparare i titoli dei virus al virus meno concentrato.
Mescolare il virus enhancer reporter e il virus reporter di controllo costitutivamente espresso in un rapporto di due a uno o tre a uno. Aggiungere una piccola quantità di colorante verde veloce con una concentrazione finale dello 0,06%Rompere la punta di una pipetta di vetro tirata ricavata da un tubo capillare graduato da microlitri forandola delicatamente in una salvietta delicata e priva di lanugine. Inserire la pipetta in un gruppo aspiratore con un dispositivo di applicazione della pressione collegato a una guarnizione di gomma per contenere una pipetta microcapillare.
Aspirare un piccolo volume di circa 0,2-0,5 microlitri di olio minerale nella pipetta applicando una pressione negativa attraverso l'aspiratore. Tenere da parte il gruppo aspiratore e posizionare il virus sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'iniezione. Dopo la crio-anestetizzazione dei topi neonatali, applicare una pressione negativa utilizzando il gruppo aspiratore e aspirare la miscela virale nella pipetta di vetro tirata fino a quando il menisco supera il segno di zecca di due microlitri.
Allontanare il mouse dalla camera fredda e posizionarlo sul banco. Individuare i siti di iniezione bilaterale a metà strada tra lambda e bregma, così come la sutura sagittale e ciascun occhio. Disinfettarli usando una salvietta imbevuta di alcool.
Forare il cranio dei topi neonatali usando la pipetta di vetro tirata. Quando l'ago entra nel cranio, applicare una pressione positiva attraverso il gruppo aspiratore. Erogare un microlitro di virus nel ventricolo laterale e ritirare la pipetta.
Posizionare il mouse su una piastra elettrica o una camera di riscaldamento per recuperare. Riporta l'animale nella gabbia di casa una volta risvegliato. Registra immagini a fluorescenza che attraversano la sezione cerebrale utilizzando una lente soggettiva 5x a basso ingrandimento.
Localizzando il sito di iniezione, valutare l'entità della trasduzione del virus, a seconda della densità e dell'intensità dei globuli fluorescenti rossi. Confronta gli animali che sono stati trasdotti in modo simile. Registra immagini fluorescenti con un obiettivo di ingrandimento superiore a 25x.
Quindi, apri il software di analisi e applica un filtro mediano tre per tre per ridurre il rumore. Fare clic sul menu Processo, quindi fare clic su Rumore e scegliere l'opzione Dispeckle. Successivamente, per sottrarre la fluorescenza di fondo dalle immagini, iniziare separando i canali di un'immagine multicanale.
Fare clic sul menu Immagine, quindi fare clic su Colore e selezionare l'opzione Dividi canali. Utilizzando lo strumento di selezione del rettangolo o del cerchio, disegnate una piccola forma in un'area dell'immagine senza celle fluorescenti. Misurare l'intensità media dei pixel dello sfondo facendo clic su Analizza, quindi su Misura, quindi ripetere per campionare più volte.
Calcolare la media del valore di grigio da cinque a otto aree di sfondo e ridurre i valori decimali. Sottrarre i valori da ciascun pixel dell'immagine selezionando il menu Processo, quindi fare clic su Matematiche e Sottrai. Quindi, immettere il valore di sfondo da sottrarre e fare clic su OK. Se necessario, unire nuovamente i canali in un'immagine multicanale selezionando il menu Immagine, quindi fare clic su Colore e selezionare Unisci canali.
Per contare il numero di cellule fluorescenti verdi, nascondere il canale verde e disegnare una forma attorno alla regione del cervello che esprime la fluorescenza rossa utilizzando lo strumento di selezione a forma libera. Fare clic sulla funzione Misura per misurare l'area, la densità integrata e il valore medio di grigio del canale rosso nella zona selezionata. Contare il numero di celle verdi utilizzando uno strumento di selezione multipunto e normalizzare il numero di celle verdi in base all'intensità integrata del canale rosso.
Dopo aver trasdotto, il reporter enhancer che il topo ha iniettato per via intracranica a P0 con un costrutto AAV positivo ha mostrato un'espressione di EGFP guidata dall'enhancer negli strati inferiori medi della corteccia 28 giorni dopo l'iniezione. Il topo iniettato con un costrutto di controllo negativo a P0 non mostra alcuna espressione di EGFP 28 giorni dopo l'iniezione, dimostrando che gli elementi enhancer sono trovati per guidare la trascrizione di EGFP nel cervello del topo. Per visualizzare con successo l'area trasdotta e controllare la potenziale variabilità, sono state esaminate le librerie di reporter enhancer fornite da AAV di diversi titoli.
La libreria di titoli elevati dei potenziatori candidati guida un'ampia espressione di EGFP mentre la libreria di titoli più bassi di potenziatori candidati guida l'espressione CGFP sparsa nel cervello del topo P7. È fondamentale mescolare il reporter potenziatore AAV con il controllo positivo ad ogni iniezione per distinguere tra potenziatori senza attività e parti falliti. Questa procedura può essere abbinata a immunoistochimica, RNA FISH o sequenziamento dell'RNA a singola cellula per determinare in quali tipi di cellule è attivo un potenziatore.
