Esse protocolo é significativo porque permite a visualização não apenas se uma sequência de intensificador pode conduzir a expressão, mas também se pode conduzir a expressão em uma parte específica do corpo. É rápido. As injeções levam menos de 10 minutos para serem concluídas, e se e onde um gene repórter é expresso pode ser visto dentro de apenas alguns dias após a coleta da amostra.
Para iniciar a clonagem, escolha ou crie uma construção de repórter. O construto aqui utilizado coloca o candidato potenciador nas três principais regiões não traduzidas de um gene repórter do EGFP expresso sob o controle do promotor mínimo hsp68. Para projetar os primers de PCR para amplificar uma sequência de interesse e clonagem no vetor, adicione o braço de homologia apropriado para clonagem de Gibson à extremidade principal dos primers.
Usando os primers projetados, execute a PCR a partir de uma amostra de DNA. Digerir de um a 10 microgramas de DNA vetorial usando Pac1 e Asc1, dependendo do número desejado de reações de clonagem necessárias. Ao empregar eletroforese de 0,7 a 1% em gel por 30 a 60 minutos a 100 volts, separe os fragmentos de digestão de restrição.
Extraia a banda para o vetor linearizado e purifique-a com um kit comercial de extração em gel. Uma vez concluída a clonagem e transformação de células de Gibson, coloque as células em meio seletivo e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após verificar a clonagem bem-sucedida do construto repórter, inocular cinco mililitros da cultura inicial usando o estoque de glicerol.
Cultive a cultura por oito a 16 horas em uma incubadora de agitação a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. À medida que o caldo ficar turvo, dilua a cultura inicial de 1.000x em 250 a 300 mililitros de caldo LB seletivo fresco e incube-o durante a noite em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto. Usando um kit maxi de plasmídeo comercial, purifique o plasmídeo.
Para testar a recombinação dos ITRs, execute uma digestão Xma1. Visualize as bandas. Certifique-se de que seu resumo mostre o número esperado de bandas.
A recombinação resultará em bandas menores do que o esperado. Prepare a mistura de AAV recombinante para entrega. Ao comparar os padrões de expressão de vários vírus repórteres intensificadores, dilua cada vírus para equiparar os títulos do vírus ao vírus menos concentrado.
Misture o vírus do repórter potenciador e o vírus do repórter de controle expresso constitutivamente em uma proporção de dois para um ou três para um. Adicione uma pequena quantidade de corante verde rápido com uma concentração final de 0,06%Quebre a ponta de uma pipeta de vidro puxada feita de um tubo capilar graduado em microlitros, perfurando-a suavemente em um lenço delicado e sem fiapos. Insira a pipeta em um conjunto de aspirador com um dispositivo de aplicação de pressão conectado a uma junta de borracha para segurar uma pipeta microcapilar.
Desenhe um pequeno volume de cerca de 0,2 a 0,5 microlitros de óleo mineral na pipeta aplicando pressão negativa através do aspirador. Mantenha o conjunto do aspirador de lado e coloque o vírus no gelo até que esteja pronto para injetar. Depois de anestesiar crioanestesiar os camundongos neonatais, aplique pressão negativa usando o conjunto do aspirador e puxe a mistura de vírus para a pipeta de vidro puxada até que o menisco passe a marca de escala de dois microlitros.
Tire o mouse da câmara fria e coloque-o na bancada. Localize os locais de injeção bilateral a meio caminho entre o lambda e o bregma, bem como a sutura sagital e cada olho. Higienize-os usando um toalhete com álcool.
Perfure o crânio dos ratos neonatais usando a pipeta de vidro puxada. À medida que a agulha entra no crânio, aplique uma pressão positiva através do conjunto do aspirador. Dispense um microlitro do vírus no ventrículo lateral e retire a pipeta.
Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou uma câmara de aquecimento para recuperar. Devolva o animal para a gaiola de casa uma vez acordado. Grave imagens de fluorescência que atravessam a seção do cérebro usando uma lente subjetiva de baixa ampliação 5x.
Ao localizar o local da injeção, avalie a extensão da transdução do vírus, dependendo da densidade e intensidade das células fluorescentes vermelhas. Compare os animais que foram transduzidos de forma semelhante. Grave imagens fluorescentes com uma lente objetiva de ampliação mais alta de mais de 25x.
Em seguida, abra o software de análise e aplique um filtro mediano de três por três para reduzir o ruído. Clique no menu Processo, clique em Ruído e escolha a opção Despeckle. Em seguida, para subtrair a fluorescência de fundo das imagens, comece separando os canais de uma imagem multicanal.
Clique no menu Imagem, clique em Cor e selecione a opção Dividir canais. Usando a ferramenta de seleção de retângulo ou círculo, desenhe uma pequena forma em uma área da imagem sem células fluorescentes. Meça a intensidade média de pixels do plano de fundo clicando em Analisar e, em seguida, em Medir e repita para a amostra várias vezes.
Faça a média do valor cinza médio de cinco a oito áreas de plano de fundo e solte os valores decimais. Subtraia os valores de cada pixel na imagem selecionando o menu Processo e clique em Matemática e Subtrair. Em seguida, insira o valor em segundo plano a ser subtraído e clique em OK. Se necessário, mescle os canais novamente em uma imagem multicanal selecionando o menu Imagem, clique em Cor e selecione Mesclar canais.
Para contar o número de células fluorescentes verdes, oculte o canal verde e desenhe uma forma ao redor da região do cérebro expressando fluorescência vermelha usando a ferramenta de seleção de forma livre. Clique na função Medir para medir a área, a densidade integrada e o valor cinza médio do canal vermelho na zona selecionada. Conte o número de células verdes usando uma ferramenta de seleção de vários pontos e normalize o número de células verdes pela intensidade integrada do canal vermelho.
Depois de transduzir o intensificador repórter que o rato injetado intracranialmente em P0 com um construto AAV positivo mostrou expressão EGFP impulsionada pelo potenciador nas camadas médias inferiores do córtex 28 dias após a injeção. O rato injetado com uma construção de controlo negativo em P0 não mostra qualquer expressão de EGFP 28 dias após a injeção, demonstrando que os elementos potenciadores são encontrados para conduzir a transcrição de EGFP no cérebro do rato. Para visualizar a área transduzida com sucesso e controlar a variabilidade potencial, foram examinadas bibliotecas de repórteres intensificadores entregues por AAV de diferentes títulos.
A biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsiona a expressão ampla do EGFP, enquanto a biblioteca de títulos inferiores dos potenciadores candidatos impulsiona a expressão CGFP esparsa no cérebro do rato P7. É vital misturar o AAV do repórter potenciador com o controle positivo em cada injeção, a fim de distinguir entre potenciadores sem atividade e partos falhados. Este procedimento pode ser emparelhado com imuno-histoquímica, RNA FISH ou sequenciamento de RNA de célula única para determinar em quais tipos de células um potenciador está ativo.
