هذا البروتوكول مهم لأنه يتيح تصور ليس فقط ما إذا كان تسلسل المحسن يمكن أن يقود التعبير ولكن حيث يمكن أن يدفع التعبير في جزء معين من الجسم. إنه سريع. تستغرق الحقن أقل من 10 دقائق لإكمالها ، ويمكن رؤية ما إذا كان يتم التعبير عن جين المراسل وأين يمكن رؤيته في غضون أيام قليلة من جمع العينة.
لبدء الاستنساخ ، اختر أو صمم بنية مراسل. يضع البناء المستخدم هنا المرشح المحسن في المنطقة الثلاثة الرئيسية غير المترجمة لجين مراسل EGFP المعبر عنه تحت سيطرة المروج الأدنى hsp68. لتصميم بادئات PCR لتضخيم تسلسل الاهتمام والاستنساخ في المتجه ، أضف ذراع التماثل المناسب لاستنساخ جيبسون إلى الطرف الأولي الخمسة من البادئات.
باستخدام الاشعال المصممة ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من عينة الحمض النووي. اهضم من واحد إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي المتجه باستخدام Pac1 و Asc1 ، اعتمادا على العدد المطلوب من تفاعلات الاستنساخ المطلوبة. من خلال استخدام 0.7 إلى 1٪ هلام الكهربائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 100 فولت ، افصل شظايا هضم التقييد.
استخرج الشريط الخاص بالناقل الخطي ، وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية. بمجرد اكتمال استنساخ جيبسون وتحويل الخلايا ، قم بطلاء الخلايا على وسائط انتقائية ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد التحقق من الاستنساخ الناجح لبناء المراسل ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من ثقافة البداية باستخدام مخزون الجلسرين.
قم بتنمية الثقافة لمدة ثماني إلى 16 ساعة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. عندما يتحول المرق إلى غائم ، قم بتخفيف ثقافة البداية 1،000x في 250 إلى 300 ملليلتر من مرق LB الانتقائي الطازج ، واحتضنها طوال الليل في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. باستخدام مجموعة ماكسي البلازميد التجارية ، قم بتنقية البلازميد.
لاختبار إعادة تركيب لوائح الاتصالات الدولية ، قم بإجراء عملية هضم Xma1. تصور العصابات. تأكد من أن الملخص الخاص بك يظهر العدد المتوقع من النطاقات.
ستؤدي إعادة التركيب إلى نطاقات أقل من المتوقع. تحضير خليط AAV المؤتلف للتسليم. عند مقارنة أنماط التعبير لفيروسات مراسل محسن متعددة ، قم بتخفيف كل فيروس لمساواة عيار الفيروس بالفيروس الأقل تركيزا.
امزج فيروس المراسل المحسن وفيروس المراسل الضابط المعبر عنه بشكل أساسي بنسبة اثنين إلى واحد أو ثلاثة إلى واحد. أضف كمية صغيرة من الصبغة الخضراء السريعة بتركيز نهائي 0.06٪ كسر طرف ماصة زجاجية مسحوبة مصنوعة من أنبوب شعري مدرج بالميكرولتر عن طريق ثقبه برفق في مناديل دقيقة وخالية من النسالة. أدخل الماصة في مجموعة شفاط باستخدام جهاز تطبيق الضغط المتصل بحشية مطاطية لحمل ماصة microcapillary.
ارسم حجما صغيرا من حوالي 0.2 إلى 0.5 ميكرولتر من الزيت المعدني في الماصة عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال الشفاط. احتفظ بمجموعة الشافطة جانبا ، وضع الفيروس على الثلج حتى يصبح جاهزا للحقن. بعد التخدير بالتبريد للفئران حديثي الولادة ، استخدم ضغطا سلبيا باستخدام مجموعة الشافطة ، وارسم خليط الفيروس في الماصة الزجاجية المسحوبة حتى يتجاوز الغضروف المفصلي علامة القراد التي تبلغ سعتها ميكرولتر.
خذ الماوس بعيدا عن الغرفة الباردة ، وضعه على سطح الطاولة. حدد موقع مواقع الحقن الثنائية في منتصف الطريق بين لامدا وبريغما ، وكذلك الخيط السهمي وكل عين. قم بتعقيمها باستخدام مناديل كحولية.
بيرس جمجمة الفئران حديثي الولادة باستخدام ماصة الزجاج المسحوبة. عندما تدخل الإبرة إلى الجمجمة ، ضع ضغطا إيجابيا من خلال مجموعة الشفاط. الاستغناء عن ميكرولتر واحد من الفيروس في البطين الجانبي ، وسحب ماصة.
ضع الماوس على وسادة التدفئة أو غرفة التدفئة للتعافي. أعد الحيوان إلى قفص المنزل بمجرد استيقاظه. سجل صور مضان تنقل قسم الدماغ باستخدام عدسة ذاتية منخفضة التكبير 5x.
من خلال تحديد موقع الحقن ، قم بتقييم مدى نقل الفيروس ، اعتمادا على كثافة وشدة خلايا الفلورسنت الحمراء. قارن بين الحيوانات التي تم تحويلها بالمثل. سجل صورا فلورية باستخدام عدسة موضوعية تكبير أعلى تزيد عن 25 ضعفا.
بعد ذلك ، افتح برنامج التحليل ، وقم بتطبيق مرشح متوسط ثلاثة في ثلاثة لتقليل الضوضاء. انقر فوق قائمة العملية ، ثم انقر فوق الضوضاء ، واختر خيار Despeckle. بعد ذلك ، لطرح مضان الخلفية من الصور ، ابدأ بفصل قنوات صورة متعددة القنوات.
انقر فوق قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد الخيار تقسيم القنوات. باستخدام أداة تحديد المستطيل أو الدائرة، ارسم شكلا صغيرا في مساحة من الصورة بدون أي خلايا فلورية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل للخلفية بالنقر فوق تحليل ثم قياس ، وكرر العينة عدة مرات.
متوسط القيمة الرمادية من خمس إلى ثماني مناطق خلفية ، وإسقاط القيم العشرية. اطرح القيم من كل بكسل في الصورة عن طريق تحديد قائمة العملية، ثم انقر على الرياضيات والطرح. بعد ذلك ، أدخل قيمة الخلفية المراد طرحها ، وانقر فوق موافق. إذا لزم الأمر ، قم بدمج القنوات مرة أخرى في صورة متعددة القنوات عن طريق تحديد قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد دمج القنوات.
لحساب عدد خلايا الفلورسنت الخضراء ، قم بإخفاء القناة الخضراء ، وارسم شكلا حول منطقة الدماغ يعبر عن التألق الأحمر باستخدام أداة التحديد الحر. انقر فوق وظيفة القياس لقياس المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية للقناة الحمراء في المنطقة المحددة. احسب عدد الخلايا الخضراء باستخدام أداة تحديد متعددة النقاط ، وقم بتطبيع عدد الخلايا الخضراء حسب الكثافة المتكاملة للقناة الحمراء.
بعد تحويل مراسل المحسن أن الفأر الذي تم حقنه داخل الجمجمة في P0 مع بنية AAV إيجابية أظهر تعبير EGFP مدفوعا بالمحسن في الطبقات السفلية الوسطى من القشرة بعد 28 يوما من الحقن. لا يظهر الفأر الذي تم حقنه ببنية تحكم سلبية عند P0 أي تعبير عن EGFP بعد 28 يوما من الحقن ، مما يدل على أن عناصر المحسن موجودة لدفع نسخ EGFP في دماغ الفأر. لتصور المنطقة التي تم تحويلها بنجاح والتحكم في التباين المحتمل ، تم فحص مكتبات مراسل محسن تم تسليمها بواسطة AAV من عيارات مختلفة.
تقود مكتبة العيار العالي للمحسنات المرشحة تعبير EGFP الواسع بينما تقود مكتبة العيار السفلي للمحسنات المرشحة تعبير CGFP المتناثر في دماغ الماوس P7. من الضروري مزج مراسل المحسن AAV مع التحكم الإيجابي في كل حقنة من أجل التمييز بين المعززات بدون نشاط وعمليات التسليم الفاشلة. يمكن إقران هذا الإجراء بالكيمياء المناعية أو RNA FISH أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد أنواع الخلايا التي ينشط فيها المحسن.
