Bu protokol önemlidir, çünkü yalnızca bir geliştirici dizisinin ifadeyi yönlendirip yönlendiremeyeceğinin değil, aynı zamanda vücudun belirli bir bölümündeki ifadeyi nereye yönlendirebileceğinin görselleştirilmesini sağlar. Hızlı. Enjeksiyonların tamamlanması 10 dakikadan az sürer ve bir muhabir geninin ifade edilip edilmediği ve nerede ifade edildiği, numune toplandıktan sonraki birkaç gün içinde görülebilir.
Klonlamaya başlamak için bir reporter yapısı seçin veya tasarlayın. Burada kullanılan yapı, geliştirici adayı, hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir EGFP muhabir geninin çevrilmemiş üç ana bölgesine yerleştirir. Bir dizi ilgi alanını yükseltmek ve vektöre klonlamak için PCR primerlerini tasarlamak için, Gibson klonlaması için uygun homoloji kolunu primerlerin beş ana ucuna ekleyin.
Tasarlanan primerleri kullanarak, bir DNA örneğinden PCR gerçekleştirin. Gerekli klonlama reaksiyonlarının istenen sayısına bağlı olarak Pac1 ve Asc1 kullanarak bir ila 10 mikrogram vektör DNA'sını sindirin. 100 voltta 30 ila 60 dakika boyunca% 0.7 ila% 1 jel elektroforezi kullanarak, kısıtlama sindirim parçalarını ayırın.
Doğrusallaştırılmış vektör için bandı çıkarın ve ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Gibson klonlaması ve hücrelerin dönüşümü tamamlandıktan sonra, hücreleri seçici ortamlara yerleştirir ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. Muhabir yapısının başarılı klonlamasını doğruladıktan sonra, gliserol stoğunu kullanarak başlangıç kültürünün beş mililitresini aşılayın.
Kültürü, sallanan bir inkübatörde 30 santigrat derecede ve dakikada 180 rotasyonda sekiz ila 16 saat boyunca büyütün. Et suyu bulanıklaştıkça, başlangıç kültürünü 250 ila 300 mililitre taze seçici LB suyunda 1.000x seyreltin ve gece boyunca 30 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde ve dakikada 180 rotasyonda inkübe edin. Ticari bir plazmid maxi kiti kullanarak, plazmidi saflaştırın.
ITR'lerin rekombinasyonunu test etmek için, bir Xma1 sindirimi gerçekleştirin. Bantları görselleştirin. Özetinizin beklenen bant sayısını gösterdiğinden emin olun.
Rekombinasyon, beklenenden daha az bantla sonuçlanacaktır. Teslimat için rekombinant AAV karışımı hazırlayın. Birden fazla geliştirici muhabir virüsünün ifade kalıplarını karşılaştırıyorsanız, virüs titrelerini en az konsantre virüse eşitlemek için her virüsü seyreltin.
Geliştirici muhabir virüsünü ve yapısal olarak ifade edilen kontrol muhabiri virüsünü iki ila bir veya üçe bir oranında karıştırın. Son konsantrasyonu %0,06 olan az miktarda hızlı yeşil boya ekleyinMikrolitre dereceli kılcal borudan yapılmış çekilmiş bir cam pipetin ucunu nazikçe delerek hassas, tüy bırakmayan bir mendil haline getirin. Pipetleri, mikrokapiler pipeti tutmak için lastik contaya bağlı basınç uygulayan bir cihazla aspiratör tertibatına yerleştirin.
Aspiratörden negatif basınç uygulayarak pipete yaklaşık 0,2 ila 0,5 mikrolitre mineral yağ gibi küçük bir hacim çekin. Aspiratör tertibatını bir kenara koyun ve enjekte edilmeye hazır olana kadar virüsü buzun üzerine yerleştirin. Yenidoğan farelerini kriyo-anestezi uyguladıktan sonra, aspiratör tertibatını kullanarak negatif basınç uygulayın ve menisküs iki mikrolitrelik kene işaretini geçene kadar virüs karışımını çekilen cam pipete çekin.
Fareyi soğuk odadan uzaklaştırın ve tezgahın üstüne yerleştirin. İki taraflı enjeksiyon bölgelerini lambda ve bregma arasındaki ortaya, ayrıca sagital sütür ve her bir gözün ortasına yerleştirin. Alkollü bir mendil kullanarak onları sterilize edin.
Çekilen cam pipeti kullanarak yenidoğan farelerinin kafatasını delin. İğne kafatasına girerken, aspiratör tertibatından pozitif bir basınç uygulayın. Virüsün bir mikrolitresini lateral ventriküle dağıtın ve pipeti çekin.
Kurtarmak için fareyi bir ısıtma yastığına veya bir ısıtma odasına yerleştirin. Uyandıktan sonra hayvanı ev kafesine geri döndürün. Düşük büyütmeli 5x öznel lens kullanarak beyin bölümünü geçen floresan görüntüleri kaydedin.
Enjeksiyon bölgesini bularak, kırmızı floresan hücrelerin yoğunluğuna ve yoğunluğuna bağlı olarak virüs iletiminin derecesini değerlendirin. Benzer şekilde dönüştürülen hayvanları karşılaştırın. Floresan görüntüleri 25x'ten daha yüksek büyütmeli objektif lensle kaydedin.
Ardından, analiz yazılımını açın ve gürültüyü azaltmak için üçe üç medyan filtre uygulayın. İşlem menüsüne tıklayın, ardından Gürültü'ye tıklayın ve Benek Gider seçeneğini seçin. Ardından, görüntülerden arka plan floresansını çıkarmak için, çok kanallı bir görüntünün kanallarını ayırarak başlayın.
Görüntü menüsüne tıklayın, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Böl seçeneğini seçin. Dikdörtgen veya daire seçim aracını kullanarak, herhangi bir floresan hücresi olmadan görüntünün bir alanına küçük bir şekil çizin. Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayarak arka planın ortalama piksel yoğunluğunu ölçün ve birden çok kez örneklemek için tekrarlayın.
Ortalama gri değerin ortalamasını beş ila sekiz arka plan alanından alın ve ondalık değerleri bırakın. İşlem menüsünü seçerek görüntüdeki her pikselden değerleri çıkarın, ardından Matematik ve Çıkar'ı tıklayın. Ardından, çıkarılacak arka plan değerini girin ve Tamam'ı tıklatın. Gerekirse, Görüntü menüsünü seçerek kanalları tekrar çok kanallı bir görüntüde birleştirin, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.
Yeşil floresan hücrelerin sayısını saymak, yeşil kanalı gizlemek ve serbest form seçim aracını kullanarak beyin bölgesinin etrafına kırmızı floresanı ifade eden bir şekil çizin. Seçilen bölgedeki kırmızı kanalın alanını, entegre yoğunluğunu ve ortalama gri değerini ölçmek için Ölçüm işlevine tıklayın. Çok noktalı bir seçim aracı kullanarak yeşil hücrelerin sayısını sayın ve yeşil hücrelerin sayısını kırmızı kanalın tümleşik yoğunluğuna göre normalleştirin.
Güçlendirici muhabiri dönüştürdükten sonra, farenin pozitif bir AAV yapısı ile P0'a intrakraniyal olarak enjekte edildiğini, enjeksiyondan 28 gün sonra korteksin orta alt katmanlarında arttırıcı güdümlü EGFP ekspresyonu gösterdi. P0'da negatif bir kontrol yapısı ile enjekte edilen fare, enjeksiyondan 28 gün sonra herhangi bir EGFP ifadesi göstermez, bu da arttırıcı elemanların fare beyninde EGFP'nin transkripsiyonunu yönlendirdiğini gösterir. Başarılı bir şekilde dönüştürülen alanı görselleştirmek ve potansiyel değişkenliği kontrol etmek için, farklı titrelerin AAV tarafından verilen geliştirici muhabir kütüphaneleri incelenmiştir.
Aday arttırıcıların yüksek titre kütüphanesi geniş EGFP ekspresyonunu yönlendirirken, aday arttırıcıların düşük titre kütüphanesi P7 fare beyninde seyrek CGFP ekspresyonunu yönlendirir. Arttırıcı muhabir AAV'yi her enjeksiyonda pozitif kontrol ile karıştırmak, aktivitesi olmayan arttırıcılar ile başarısız teslimatlar arasında ayrım yapmak için hayati önem taşır. Bu prosedür, bir arttırıcının hangi hücre tiplerinde aktif olduğunu belirlemek için immünohistokimya, RNA FISH veya tek hücreli RNA dizilimi ile eşleştirilebilir.
