Нуклеозиды и нуклеотиды являются центральными метаболическими компонентами во всех живых организмах. Метаболизм их необходим для развития клеток. Этот подход обеспечивает мощный инструмент для количественной оценки этих метаболитов.
Этот метод позволяет быстро и точно количественно определять нуклеозиды и нуклеотиды в растениях. Полная предварительная обработка образцов и анализ LC-MS / MS занимают около двух дней для набора из 10-20 образцов. Этот метод можно применять ко всем растениям и даже другим организмам.
Продемонстрировать процедуру будет Чанхуа Чжу, адъюнкт-профессор из Лаборатории Чэнь. Чтобы вырастить растения, убедитесь, что семена Arabidopsis стерилизованы в 70% этаноле в течение 10 минут и посеяны на агаровых пластинах с питательными веществами 1/2 силы Murashige и Skoog. Высиживая пластины в темноте при четырех градусах Цельсия в течение 48 часов, затем перенесите их в контролируемую камеру роста под 16 часами света при 22 градусах Цельсия и восемью часами темноты при 20 градусах Цельсия.
Соберите 100 миллиграммов двухнедельной рассады и заморозьте их в жидком азоте для извлечения метаболитов. Измельчите 100 миллиграммов замороженных растительных тканей с семью-восемью стальными шариками в предварительно охлаждаемой смесительной мельнице в течение пяти минут с частотой 60 Гц. Готовят экстракционный раствор, который содержит метанол, ацетонитрил и воду в соотношении два к одному.
Повторное суспендируемые гомогенизированные материалы одним миллилитром экстракционного раствора. Центрифугируют полученный раствор при 12 000 XG в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем переложат 0,5 миллилитра суспензии в новую трубку объемом 1,5 миллилитра и заморозят в жидком азоте. Выпарить замороженный образец в сублимационной сушилке и повторно суспендировать его в 0,5 миллилитра 5% ацетонитрила и 95% воды.
Центрифугируют полученный раствор при 4 000 XG в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Загрузите супернатант во флакон для измерения LC-MS/MS. Приготовьте 10-миллимолярный буфер ацетата аммония, растворив 1,5 грамма ацетата аммония в двух литрах двойной деионизированной воды.
Отрегулируйте рН до 9,5 с 10% аммония и ацетатной кислоты. Подготовьте два литра сверхчистого 100% метанола для измерения нуклеозидов, затем подготовьте два литра сверхчистого ацетонитрила для измерения нуклеотидов. Впрыскиваем 0,02 миллилитра предварительно обработанной экстракции метаболита каждого ранее подготовленного образца в систему ВЭЖХ с бинарными насосами в сочетании с тройным четырехкратным масс-спектрометром.
Чтобы сгенерировать стандартные калибровочные кривые, объедините шесть извлечений образцов вместе и вихрьте смесь, а затем снова аликвотируйте ее до шести экстракций, чтобы получить каждый фон. Добавьте шесть различных концентраций каждого стандарта к этим шести экстракциям соответственно и вводите их одну за другой в систему ВЭЖХ. Регистрировать пиковые области каждого стандарта в разных концентрациях через массовые переходы.
Этот протокол использовался для идентификации и количественной оценки N1-метиладенозина, известного модифицированного нуклеозида, в двухнедельных саженцах дикого типа Arabidopsis. Профиль масс-спектрометрии показал, что ионы продукта, образующиеся из стандарта N1-метиладенозина, имеют соотношение 150 и 133 МЗ. И такой же профиль наблюдался в Колумбии нулевой добычи.
Из-за высокой обилия продукта-иона 150 МЗ для идентификации N1-метиладенозина был выбран массовый переход от 282,1 до 150. Время удержания целевого пика составило 7,05 минуты. Аналогично времени удержания стандарта N1-метиладенозина.
Серия концентраций стандартов N1-метиладенозина была добавлена в шесть образцов экстракции. Стандартные образцы вводили в LC-MS/MS, и увеличенные пиковые площади N1-метиладенозина были построены в сопоставлении с номинальными концентрациями стандартов. Шесть равных фоновых извлечений важны для создания точной и повторяемой калибровочной кривой для количественной оценки.
Наш метод может быть применен для изучения метаболических путей в растениях. Сравнивая профили метаболитов между мутантами дикого типа и мутантами с потерей функции, можно было бы вывести метаболический поток.
