Методика, которую мы представляем сегодня, позволяет анализировать активность нейронов спинного мозга в результате внутреннего нейронного фактора и влияния окружающих астроцитов. Этот метод надежно генерирует как человеческие нейроны, так и человеческие астроциты, которые специфичны для спинного мозга, и использует функциональную выходную меру, которая может быть масштабирована для воспроизводимости. Представленная нами методика позволяет исследовать специфические заболевания нейронов спинного мозга, такие как боковой амиотрофический склероз, с использованием нейронов пациентов со спорадическими или генетическими заболеваниями.
Для начала исследуйте пластины iPSC человека на наличие достаточно плотных колоний таким образом, чтобы в центре колоний отображались разбросанные белые области. Затем, чтобы начать упаковку ячеек, проведите линии сетки на нижней внешней поверхности пластин маркером, чтобы облегчить точное покрытие всей пластины. Используйте фазово-контрастный микроскоп с 10-кратным увеличением в культуре, чтобы отделить дифференцированные колонии путем ручного соскабливания с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров.
Затем дважды промойте пластины PBS. А затем добавляют пять миллилитров тканевой диссоциации протеазы, предварительно нагретой при 37 градусах Цельсия. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов цельсия в течение четырех-семи минут, пока края колоний не начнут округляться, прежде чем поднимать колонии из пластины.
Осторожно аспирируйте диссоциационную протеазу и осторожно промойте пластину дважды PBS, не смещая колонии. Добавьте пять миллилитров предварительно нагретой человеческой среды iPSC в культуральную пластину. Затем поцарапайте всю пластину кончиком пятимиллилитровой пипетки движением вперед и назад сверху вниз и поднимите колонии, разбив их на более мелкие клеточные агрегаты.
Для дифференцировки iPSC человека в нейронные клетки-предшественники. Как только человеческий iPSC образует монослой и становится на 90% сливающимся, начинают дифференциацию, как описано в рукописи. На 12-й день, после обработки трипсином, если клетки не находятся в суспензии, отделяйте клетки механически путем выброса нервной индукционной среды из кончика пипетки 1000 микролитров на клетки круговым движением, чтобы покрыть всю поверхность.
Если культуры нейронных клеток-предшественников были заморожены, разморозьте их. После обмена средой и промывки PBS, как описано в рукописи, измените среду с помощью среды дифференцировки двигательных нейронов, содержащей 0,02 микромолярного цитозина арабинозида, затем инкубируют клетки в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, когда глиальные преданные предшественники появляются как одиночные пролиферирующие плоские клетки под постмитотическими предшественниками двигательных нейронов, агрегируется в клеточные кластеры. Позже осуществлялся средний обмен, как указано в рукописи.
В день нанесения покрытия или раньше, начните наносить покрытие 24 плит MEA скважины, сначала разбавляя PLO в воде или PBS. Затем добавляют от 15 до 20 микролитров ПЛО в каждую скважину, образуя каплю по центру скважины, покрывая площадь электрода, гарантируя, что электроды не повредятся наконечником пипетки. Добавьте воду в отсеки, окружающие колодцы, обеспечив достаточную влажность.
И высиживать ООП при 37 градусах Цельсия в течение одного-двух часов. Затем, используя пластиковый наконечник микропипетки, аспирируйте как можно больше PLO, не касаясь электродов. Далее трижды промыть колодец 250 микролитрами воды.
Используя наконечник пипетки, удалите как можно больше воды и дайте поверхности высохнуть со снятой крышкой. Затем добавьте от 15 до 20 микролитров разбавленного ламинина, чтобы покрыть каждый электродный массив. После добавления воды в отсеки влажности и замены крышки, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение как минимум двух часов до ночи.
В день покрытия, после промывки двигательных нейронов и культур астроцитов один раз с PBS, добавьте 0,05% трипсина и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение примерно пяти минут, чтобы поднять клетки. Соберите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую ингибитор трипсина. И мойте тарелки со средой или основанием, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
Гранулируйте клетки путем центрификации. А затем, используя пипетку объемом 1000 микролитров, повторно суспендируйте двигательные нейроны и астроциты с помощью кокультурной среды, содержащей 20 микромоляров ингибитора ROCK, чтобы получить один миллилитр одной клеточной суспензии. С помощью гемоцитометра подсчитайте двигательные нейроны и астроциты.
А пока подсчитывали, держали ячейки суспензии и помещали их в стойку из пенополистирола при четырех градусах Цельсия. Центрифугировать один миллилитр обеих клеточных суспензий в 300 раз G в течение пяти минут. Рассчитайте нужный объем и повторно суспендируйте гранулы.
Соедините необходимый объем суспензий нейронов и астроцитов в равных соотношениях и аккуратно перемешайте, дважды пипетировав, чтобы тщательно соединить. Затем удаляют ламинин из каждой лунки пластины и переносят 10 микролитров конечной комбинированной клеточной суспензии в каждую лунку, образуя небольшую каплю, покрывающую электродную решетку. Инкубируйте пластины с нетронутой клеточной каплей при 37 градусах Цельсия в течение 20-30 минут, чтобы сформировать первоначальные прикрепления на пластинах.
Затем пипетка 250 микролитров теплой кокультурной среды, содержащей ингибитор ROCK, опускается на стенку каждой скважины и пипетка такого же объема на противоположной стенке каждой скважины и инкубирует пластину при 37 градусах Цельсия в течение 24-36 часов. На следующий день осмотрите пластины на наличие мусора или мертвых клеток. А при необходимости обменять среду со свежей кокультурной средой, содержащей ингибитор ROCK.
В противном случае выполняйте половинные обмены среды два раза в неделю, используя среду для совместной культивирования без ингибитора ROCK, начиная со второго дня совместной культивации. Чтобы выполнить запись, начните как можно скорее после первого дня совместной культивации, установив температуру до 37 градусов по Цельсию и углекислый газ на уровне 5%, затем переложите пластины на записывающую машину и уравновесьте в течение не менее пяти минут перед записью. Записывайте базовую активность через день или еженедельно в течение одного-15 минут в зависимости от экспериментального проекта.
Чтобы исследовать переходные электрофизиологические эффекты соединений, нацеленных на нейроны или астроциты, удалите крышку пластины, но держите крышку машины закрытой и регистрируйте базовую активность в течение как минимум одной минуты. Вручную открывают крышку машины без остановки электрофизиологической записи и обменивают 25 микролитров среды с соответствующим лекарственным средством. Затем закройте крышку вручную и при необходимости запишите в течение дополнительных минут.
Аналогично протестируйте интересующий препарат. В этом протоколе hiPSCs поддерживались и проходили как несмешивающиеся колонии. Нейрогенез был инициирован путем двойного ингибирования SMAD путем инактивации путей BMP и TGF-бета.
Полученные нейроэпителиальные стволовые клетки разделились и образовали многослойный эпителий. Раннее воздействие факторов роста нейронов и глиогенного цилиарного нейротрофического фактора породило смешанную популяцию клеток-предшественников. Нейроны возникли спонтанно из этой смешанной популяции.
Глиогенный переключатель индуцировал дифференцировку астроцитов путем активации пути JAK-STAT. Идентичность спинного мозга обработанных ингибитором насечки и дифференцированных клеток двигательных нейронов поддерживалась высокими уровнями экспрессии холина ацетилтрансферазы. На 90-й день после культуры in vitro астроциты iPSC человека демонстрировали созревающий фенотип, о чем свидетельствует экспрессия S100 beta и GFAP, в то время как их региональная идентичность спинного мозга поддерживалась экспрессией ястребов ранее.
Совместно культивируемые клетки спонтанно перестраиваются с астроцитами, создавая питательный слой внизу и нейроны, соединяющие сети наверху. Нейроны агрегировались в большие кластеры клеток при культивировании в одиночку, в то время как кокультура двигательных нейронов iPSC человека с человеческими астроцитами iPSC приводила к равномерно распределенным монослоям. Астроциты iPSC человека усиливают электрофизиологическое созревание двигательных нейронов iPSC человека, о чем свидетельствуют более высокие степени всплесков и разрывов активности в кокультурах.
По нашему опыту, культура стволовых клеток и ранняя дифференцировка NPC являются наиболее сложными и чувствительными к технической ошибке. На этом этапе методы не должны выполняться с последовательностью и точностью с небольшим запасом для устранения неполадок. Описанные здесь методы кокультуры могут быть использованы и в других моделях, специфичных для типа клеток.
