Мы построили однородный анализ на основе бисера для изучения взаимодействия шаперон-кохаперон. Используя этот метод, мы проверяем небольшие молекулы, ингибирующие взаимодействия между Hsp90 и FKDP51 или FKBP52, и идентифицируем мощные и селективные ингибиторы. Этот высокопроизводительный метод скрининга является надежным и надежным.
Результаты могут быть получены в течение одного часа, и для этого требуется лишь небольшое количество белка и соединений бусин. Взаимодействие Hsp90 с этим кохапероном было связано с расстройствами человека, такими как болезнь Альцгеймера, рак, аутоиммунные заболевания. Данная методика дает возможность скрининга ингибиторов шаперона-кохаперона, имеющих высокую медицинскую значимость.
Вот основной принцип этого анализа. Когда взаимодействие между Hsp90C-концевым пептидом и доменом TPR кохаперонов приводит к сближению донорских и акцепторных шариков, генерируется сильно усиленный сигнал. Когда добавляются ингибиторы взаимодействия, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости, и не производится обнаруживаемый сигнал.
Начните с разбавления пептида Hsp90 в PBS в концентрации одного миллиграмма на миллилитр. Разбавьте неконъюгированные акцепторные шарики в PBS и переложите шарики в 1,5-миллилитровый тюбик. Центрифугируют разбавленные шарики для стирки, а затем аккуратно удаляют супернатант.
Для конъюгирования устанавливают акцепторные шарики в пептидах в соотношении 10 к 1. К шарикам палетида на PBS разбавляют пептид, Tween 20 и раствор цианаборогидрида натрия, и инкубируют с сквозным перемешиванием на ротационном шейкере. Чтобы заблокировать непрореагировавые участки, добавьте к шарикам 20 микролитров одного молярного раствора гидрохлорида Триса рН 8,0 и погасите реакцию путем инкубации в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации промыть шарики центрифугированием и повторно суспендировать гранулу бусины в одном миллилитрах раствора гидрохлорида Триса. Повторите стирку еще два раза. После последней промывки повторно суспендировать шарики при концентрации в один миллиграмм на миллилитр в буфере для хранения и хранить сопряженный раствор акцептора при 4 градусах Цельсия, защищенный от света.
Добавьте донорские шарики глутатиона при концентрации 10 микрограммов на миллилитр в PBS. Добавьте GSTFKBP51 к конечной концентрации 10 мкг на миллилитр и инкубируют реакцию в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия в темноте. Производят серийные разбавления исследуемого соединения в ДМСО.
Добавьте 0,25 микролитра искомого растворения соединения и утроение в углу каждой лунки плиты из 384 скважин. Для отрицательного контроля добавьте 0,25 микролитра DMSO, а для положительного контроля добавьте 0,25 микролитра пептида Hsp90 C-Terminal в скважины. Добавьте в каждую лунку 22,5 микролитра раствора, содержащего донорские шарики глутатиона с белками, помеченными GST.
Тщательно встряхните тарелку руками и высиживание в темноте при 25 градусах Цельсия в течение 15 минут. Разбавляют акцепторные шарики присоединенным пептидом Hsp90C-Terminal до 100 мкг на миллилитр концентрации в 0,5 раза PBS. Добавьте 2,25 микролитра разбавленных акцепторных шариков в каждую лунку.
Встряхните и высиживните пластину в темноте в течение 15 минут, как показано на демонстрации. Включите прибор считывателя пластин, измерьте сигнал пластины и проанализируйте данные, как описано в тексте рукописи. Создайте таблицу данных X-Y в диалоговом окне приветствия, выберите X numbers, Y и введите три повторяющихся значения в параллельные столбцы.
Импортируйте значения концентрации в столбец X, а значения сигнала в столбец Y. Нажмите кнопку «Анализировать», выберите «Преобразовать концентрацию X», а затем выберите «Преобразовать в логарифмы». Нажмите «Анализировать» и выберите нелинейную регрессию в разделе «Анализ X-Y».
Откройте опцию ингибирования реакции дозы и выберите уравнение наклона log и переменной реакции. Нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть результаты, содержащие значение IC50 и графики. Этот анализ использовался для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.
Оценка Z более 0,8 и отношение сигнал/фон 13,35 демонстрируют прочность и надежность для скрининга с высокой пропускной способностью. Оценивали влияние маломолекулярного тестового соединения D10 на ингибирование взаимодействий шаперон-кохаперон и рассчитывали значения IC50, где D10 показывал дозозависимое ингибирование. Значение IC50 для взаимодействий Hsp90 GSTFKBP51 составляло 65 наномоляров.
В то время как для взаимодействий Hsp90, GSTFKBP52 полное ингибирование не было достигнуто при самой высокой концентрации соединения, что указывает на то, что селективное ингибирование белково-белкового взаимодействия с малыми молекулами может быть достигнуто. Критическим шагом является порядок сложения. Сначала мы формируем комплекс между небольшой молекулой и ее мишенью TPR.
В противном случае требуется более длительная инкубация и более высокие концентрации соединений. Мы можем использовать этот метод для скрининга малых молекул, нарушающих взаимодействие между Hsp90 и FKB51 или Hsp90 и FKB52. Он также может быть распространен на любое взаимодействие между Hsp90, Hsp70 и мотивом TPR, содержащим селективные ингибиторы скрининга кохаперона.
