Даже очень ранние эмбрионы содержат много различных сигнальных молекул, что может затруднить распознавание полной функции любого отдельного эмбрионального сигнала. Изолируя клетки от эндогенных сигнальных центров, эти экспланты позволяют исследователям изучить роль данной сигнальной молекулы в относительной изоляции. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем рекапитулировать эмбриональное время, движения клеток и паттерны экспрессии генов в упрощенной системе ex-vivo без времени или усилий, необходимых для поддержания стволовых клеток в культуре.
Начните с разрезания эксплантов из неинфицированных эмбрионов. Если экспланты расширяли культуру, то срез делали близко к желтку. Начните с заполнения вытянутой стеклянной капиллярной иглы РНК.
Поместите заполненную иглу в микро-манипулятор и разбейте кончик иглы щипцами. Калибруйте объем впрыска с помощью ступенчатого микрометра с каплей минерального масла, регулируя время впрыска и давление на пневматический инжектор для достижения болюса нужного размера. Держите наконечник иглы РНК погруженным в масло до готовности к инъекции.
Загрузите эмбрионы в инъекционную пластину с помощью пипетки Пастера и пипетки, а затем используйте палец в перчатке, чтобы аккуратно вдавить яйца в корыта. Вводят 10 пикограмм NDR2 РНК в желток одноклеточных эмбрионов до тех пор, пока не будет достигнуто нужное количество эмбрионов или пока эмбрионы не начнут делиться. Используйте нежную струю яичной воды из бутылочки для выжимания, чтобы вымыть эмбрионы из инъекционной тарелки в маркированную чашку Петри.
Поместите эмбрионы в инкубатор с 28,5 градусами Цельсия, пока они не достигнут стадии 128 клеток. Удалите из блюда неодобрённые яйца и отмершую зародыш. Как только эмбрионы достигнут стадии 128 клеток, поместите их в помеченные стеклянные чашки Петри и отстойте из них как можно больше яичной воды.
Маркируют стеклянные кристаллизующиеся блюда лабораторной лентой, соответствующей названиям небольших блюд, и заполняют две трети пути яичной водой. Поместите эти блюда рядом с рассекающим микроскопом для быстрого доступа. Добавьте один миллилитр по 20 миллиграммов на миллилитр проназного бульона, размороженный на льду, до 15 миллилитров раствора 3X Данио в конической трубке на 50 миллилитров.
Добавьте не менее пяти миллилитров раствора проназы в каждую стеклянную чашку Петри, содержащую эмбрионы. Перемешивают стеклянную посуду круговыми движениями, последовательно контролируя ход дехорионации под рассекающим микроскопом. Как только хорионы начнут сморщиваться и один-два эмбриона выходят из своих хорионов, осторожно окуньте стеклянную чашку Петри, содержащую проназу и эмбрионы, в соответствующую стеклянную кристаллизующуюся чашку, содержащую яичную воду.
Трижды вымойте эмбрионы с яйцом и выпейте яичную воду из посуды. Выполните третью и заключительную промывку раствором 0,3X Данио. Накройте дехорионированные эмбрионы крышкой чашки Петри и верните их в инкубатор при 28,5 градусах Цельсия, пока они не достигнут 256-клеточной стадии.
Наполните чашку Петри, покрытую агарозой, раствором 3X Danieau. Как только эмбрионы находятся на 256-клеточной стадии, перенесите их в покрытую агарозой пластину, содержащую раствор 3X Данио, выровняв их вдоль центра чашки. Используйте одну пару щипцов, удерживаемых закрытыми, чтобы стабилизировать эмбрион, и используйте другую, чтобы прорезать бластодерму.
Чтобы разрезать, аккуратно сожмите клетки бластодермы одной парой щипцов, затем возьмите стабилизирующими щипцами и проведите ими вдоль других щипцов, чтобы разрезать примерно наполовину через бластодерму. Поверните эмбрион, поместив щипцы в существующий разрез, а затем отрежьте оставшуюся бластодерму ортогонально к первому разрезу. Держите экспланты в растворе 3X Danieau не менее пяти минут для заживления, а затем перенесите их в покрытый агарозой колодец шестистворчатой пластины, заполненной четырьмя миллилитрами эксплантовой среды.
Поместите эксплантные культурные пластины в инкубатор с 28,5 градусами Цельсия до тех пор, пока не будет достигнута желаемая точка времени или стадия. Чтобы разрезать химерные экспланты, используйте блюдо с агарозой, отлитое в 12 небольших неглубоких колодцах с использованием одного миллиметра стеклянных бусин. Наполните пластину раствором 3X Danieau.
Готовят, добавляя 12 эмбрионов одного генотипа или состояния к левой стороне пластины, и 12 эмбрионов другого генотипа обусловлены правой стороной пластины. Переместите один эмбрион каждого состояния в центр плиты возле одной из 12-х скважин. Используя щипцы, вырежьте эксплант из каждого эмбриона, как описано для эксплантов одного эмбриона.
Быстро прижмите срезанные края двух эксплантов вместе в неглубоком колодце, используя щипцы, чтобы позволить двум половинкам зажить вместе в одном экспланте. Продолжайте с оставшимися 12 скважинами внутри плиты. Как только экспланты заживут, перенесите их в покрытый агарозой колодец шестистворчатой пластины, заполненной четырьмя миллилитрами эксплантовой среды.
Повторяйте до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество эксплантов. Культура эксплантируется в инкубаторе с 28,5 градусами Цельсия до тех пор, пока неповрежденные эмбрионы братьев и сестер не достигнут желаемой стадии. Контрольные экспланты, вырезанные из неинфицированных эмбрионов дикого типа или те, кому вводили 50 пикограмм мРНК, кодирующих зеленый флуоресцентный белок, оставались округлыми в течение всего периода культивирования и не смогли экспрессировать маркеры мезодермы, эндодермы или нейроэктодермы.
Экспланты, вырезанные из эмбрионов, введенных с 10 пикограммами мРНК ndr2, стали сильно вытянутыми после восьми-девяти часов в культуре. Живая покадровая визуализация этих эксплантов с помощью дифференциальной интерферинговой контрастной микроскопии показала, что расширение происходит примерно через восемь часов после оплодотворения. Экспланты из эмбрионов, введенные с 10 пикограммами nDR2, демонстрировали надежную экспрессию маркеров мезодермы, tbxta, noto, tbx16 и нейроэктодермного маркера sox2.
Очень важно разрезать экспланты значительно выше эмбрионального края. В противном случае экспланты будут содержать эндогенные сигналы с края и не будут наивными. В этом методе экспланты использовались для решения роли узловой сигнализации в морфогенезе гаструляции.
В будущем другие исследователи могут использовать этот подход для проверки роли дополнительных сигнальных молекул, например, в любом количестве процессов развития.
