Использование различных энергетических субстратов является как специфическим для типа клеток, так и показательным для заболевания. Измерение потребления конкретных субстратов может пролить свет как на нормальную биологию, так и на патологию. Техника не нуждается в специализированном оборудовании и легко масштабируется.
Он также проще в использовании, чем предыдущие опубликованные методы. Понимание изменений в скорости окисления субстрата позволит разработать диетические и фармакологические вмешательства для метаболических нарушений. Несмотря на то, что этот метод демонстрируется с костной тканью, он легко настраивается для изучения метаболической гибкости во всех типах клеток, обеспечивая понимание как причин, так и последствий метаболических сдвигов.
После жертвоприношения детенышей в течение трех-пяти послеродовых дней переведите их на ледяной D PBS, содержащий пенициллин стрептомицин двойной раствор антибиотика. Обнажите кальварию путем удаления кожи и мягких тканей. Соберите среднюю область, разрезав окружающие ткани сзади спереди в D PBS.
Поцарапайте внутреннюю и внешнюю поверхности кальварии осторожно, используя пинцет, чтобы помочь освободить клетки при последующем пищеварении. Готовят по 2 и 4 миллиграмма на миллилитр растворов коллагеназы второго типа в D PBS и фильтруют каждый раствор свежим 0,22-микрометровым фильтром. Сначала переварите очищенную кальварию с двумя миллиграммами на миллилитр раствора коллагеназы в течение 15 минут, а затем выбросьте раствор для пищеварения.
Затем переварите чистые образцы по четыре миллиграмма на раствор миллилитра коллагеназы трижды в течение 15 минут каждый раз. Затем потяните раствор для пищеварения и сохраните его. Фильтруйте раствор для пищеварения через 70-микрометровые клеточные ситечки и центрифугируйте фильтрат при 300 RCF в течение пяти минут.
Повторно суспендировать клеточную гранулу в полной альфа-среде MEM, содержащей 10% FBS и пенициллин стрептомицин двойной раствор антибиотика. Подсчитайте и посейте клетки в 10-сантиметровую пластину. Культивируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение трех дней.
Затем диссоциируют клетки при 37 градусах Цельсия с 0,25 трипсина ЭДТА. После пищеварения подсчитайте и посейте клетки в 24-луночную пластину клеточной культуры с полной альфа-средой MEM, содержащей 10% FBS и пенициллин стрептомицин двойной раствор антибиотика. Засейте по меньшей мере четыре лунки на тип ячейки на субстрат и, по меньшей мере, три дополнительные скважины для каждого типа клеток для подсчета до анализа.
Культивируйте клетки при температуре 37 градусов цельсия в течение ночи. После удаления мышечной и соединительной ткани у восьминедельных мышей и сбора бедренных и большеберцовых костей острыми ножницами разрезают и отбрасывают оба конца костей. Смывайте костный мозг из одной бедренной кости и одной большеберцовой кости в свежую 10-сантиметровую чашку Петри со шприцем, снабженным иглой 23 калибра, содержащей 15 миллилитров полной альфа-среды MEM с 10% FBS пенициллина стрептомицина двойного раствора антибиотика и 10% CGM 14 12 кондиционированной среды.
Культивируйте клетки в чашке Петри в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Через три дня отбросьте культуральную среду и промойте клетки D PBS. Диссоциируют прикрепленные клетки при 37 градусах Цельсия с 0,25% трипсина ЭДТА в течение пяти минут.
После центрифугирования повторно суспендировать ячейку гранулы в среде BMM. Подсчитайте и посейте клетки в 24-луночную пластину для культивирования клеток в соответствии с процедурой, описанной ранее. Культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи в среде BMM перед началом анализов.
Промывайте ячейки в дополнительных колодцах дважды с помощью D PBS. Диссоциируют клетки с 0,25% трипсина ЭДТА. Суспендировать 20 микролитров переваренных клеток в D PBS.
С помощью 20 микролитров раствора красителя акридина оранжевого и йодида пропидия определите количество живых клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток и запишите их количество. Промывайте ячейки в пробирных колодцах дважды с помощью D PBS. Добавьте 500 микролитров горячей среды к каждому анализу хорошо в выделенной RAM вытяжке для культивирования тканей.
После запечатывания пластины парапленкой, инкубируйте клетки в назначенном ОЗУ инкубаторе при 37 градусах Цельсия в течение 4 часов. Во время инкубации нарежьте фильтровальную бумагу на круглые кусочки, немного большие, чем площадь внутри крышки 1,5-миллилитра микроцентрифужной трубки, и вставьте бумагу плотно в колпачок. Добавьте 200 микролитров одной молярной хлорной кислоты в каждую трубку и 20 микролитров гидроксида натрия в фильтровальную бумагу, установленную внутри колпачка.
После инкубации клеток переложите 400 микролитров питательной среды из каждой лунки в подготовленные трубки и немедленно закройте колпачки. Оставьте трубки в трубчатой стойке при комнатной температуре на один час. Параллели во время инкубации устанавливают для каждой трубки сцинтилляционный флакон и заполняют его четырьмя миллилитрами сцинтилляционной жидкости.
Переложите каждый кусочек фильтровальной бумаги в сцинтилляционный флакон и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Проведите тесты салфеток на вытяжке для культивирования тканей, водяной бане, холодильнике, инкубаторе, раковине, земле и любой другой рабочей зоне на предмет потенциального загрязнения оперативной памяти. Поместите бумажные салфетки в сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость.
Измерьте радиоактивность углерода 14 в сцинтилляционных флаконах с помощью сцинтилляционного счетчика и запишите результаты считывания. При необходимости обеззараживайте рабочую среду в соответствии с руководящими принципами радиационной безопасности. На рисунке сравнивается окисление субстрата первичными кальвариями до остеобластов и КБМ.
После того, как первичные клетки проходят и культивируются в полной альфа-среде MEM в течение ночи, они обычно достигают 80-90% конфлюзии и демонстрируют свою характерную морфологию. Кальвариальные преостеобласты заметно больше, чем BBM. Результаты окисления субстрата показали, что скорость окисления для каждого субстрата значительно выше в кальвариальных предостеобластах, чем в КБМ, что, вероятно, указывает на более высокую выработку энергии путем окислительного фосфорилирования в предостеобластах.
Вставленная третья бумага должна быть немного больше, чем крышка верхней трубки ebin объемом 1,7 миллилитра. Этот метод может быть использован в сочетании с потреблением кислорода и для определения общей скорости окислительного фосфорилирования и лактативной продукции в клетках. Этот протокол может быть использован для определения использования субстрата на различных стадиях дифференциации или в условиях заболевания.
Обладая этими знаниями, мы можем разрабатывать вмешательства для метаболических нарушений.
