В этом протоколе подробно описывается определение скорости липолиза адипоцитов в культивируемых адипоцитах или жировой ткани ex vivo, что позволяет сравнивать липолитические показатели между мышиными моделями или методами лечения. Этот протокол использует последовательную выборку, которая позволяет внутренне подтвердить, что липолиз измеряется в линейной фазе, и снижает погрешность измерения. При оптимизации этот протокол может быть использован для измерения липолиза в бурой жировой ткани, жировой ткани других организмов или адипогенных клеточных линиях.
Ткани ex vivo должны быть измельчены на небольшие куски постоянного размера и формы, чтобы обеспечить секвестрацию высвобожденных свободных жирных кислот BSA в среде. Для начала приготовьте 5%-ную среду BSA, растворив пять граммов бычьего сывороточного альбумина, или BSA, в 100 миллилитрах модифицированной орлиной среды Dulbecco, или DMEM, без фенольного красного. Аккуратно перемешайте раствор, чтобы растворить БСА.
Затем готовят рабочие концентрации контрольных и стимулирующих сред. Перед использованием нагрейте носитель до 37 градусов Цельсия. Наклейте этикетку на 96-луночную пластину для сбора носителей.
Внутри стерильного вытяжного шкафа проводят изоляцию и дифференцировку 100% сливающихся первичных преадипоцитов. Каждые два-три дня меняйте питательные среды, содержащие инсулин, поддерживая объем один миллилитр на лунку. Для этого исследования используйте только культуры с коэффициентом дифференциации выше 90% и одинаковыми в разных группах.
Затем культивируют клетки в безинсулиновых средах в течение 24 часов перед измерением липолиза. Промойте клетки DPBS один раз, чтобы удалить остатки сыворотки из питательной среды. Подготовьте 48-луночную тарелку с одной лункой для каждой реплики.
Поместите 400 микролитров DMEM комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться. Используйте от двух до четырех контрольных и от двух до четырех стимулированных лунок на ткань на мышь. Подготовьте шестилуночную пластину с одним отверстием для каждой ткани, которая будет собрана у каждой мыши, и поместите четыре миллилитра DMEM комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться.
Поместите собранную гонадную жировую ткань в шестилуночную пластину. Извлеките ткань из лунки. Положите его на силиконовый коврик и разрежьте ножницами на кусочки по пять-семь миллиграммов.
Промокните салфетки на чистом полотенце, чтобы удалить все носители. Затем взвесьте от 25 до 30 миллиграммов, что эквивалентно пяти или шести кусочкам ткани, для каждой пробирной лунки и поместите их в заранее подготовленную пробирную пластину с 48 лунками. Взвесьте весовую лодку после удаления салфеток и запишите вес любых оставшихся остатков.
Протрите весовую лодку между образцами и при необходимости снова разорвите. Используйте новую весовую лодку для каждой ткани. После того, как все образцы тканей будут взвешены, поместите 48-луночную пробирную пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия под 10% углекислого газа на 15 минут.
Выполняйте сбор мультимедиа в стерильном вытяжном шкафу. В нулевое время, после удаления среды, добавьте 400 микролитров контрольной или стимулирующей среды на лунку и поместите пробирную пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа. Для культивирования тканей ex vivo осторожно удаляйте среду с помощью пипетки и избегайте отсасывания.
Иногда через один, два, три и четыре часа собирают 200 микролитров среды, заменяют ее 200 микролитрами соответствующей контрольной или стимулирующей среды и возвращают пробирную пластину в инкубатор. Храните сборную тарелку при температуре четыре градуса Цельсия. Разморозьте и перемешайте образцы.
Нагрейте реагенты до комнатной температуры и растворите одну бутылку цветного реагента А, используя одну бутылку растворителя А, и одну бутылку цветного реагента В, используя одну бутылку растворителя В. После создания стандартной кривой свободной жирной кислоты или FFA пипетки и образцы помещают в 96-луночную тестовую пластину. Рекомендуемый объем образца составляет 10 микролитров на лунку. Добавьте в каждую лунку по 150 микролитров реагента А и перемешайте.
Инкубируйте пробирную пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Считайте поглощение пластины на 550 нанометрах и 660 нанометрах и назовите это чтением A. Добавьте 75 микролитров реагента B в каждую лунку и перемешайте. Инкубируйте пробирную пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Затем, вынув пластину из инкубатора, снова считайте поглощение пластины на 550 и 660 нанометрах. Обратитесь к этому чтению как к чтению B. Восстановите свободный глицериновый реагент с 36 литрами сверхчистой воды и акклиматизируйте его до комнатной температуры. Разморозьте и перемешайте образцы.
Создайте стандартную кривую глицерина, сделав 7,2-кратное последовательное разбавление стандартного раствора глицерина и водяную заготовку. Пипетка 25 микролитров каждого стандарта и пробы в 96-луночную пробирную пластину. Добавьте в каждую лунку по 175 микролитров свободного глицеринового реагента и перемешайте.
Инкубируйте пробирную пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Вынув пластину из инкубатора, считайте поглощение пластины в 540 нанометров. Выполните шаги, описанные в тексте, чтобы рассчитать липолитические показатели в соответствующих значениях квадрата R.
Затем, используя скорость производства FFA и глицерина для каждого образца в качестве отдельной точки данных, выполните статистический анализ и построите график значений, если сравниваются разные липолитические скорости. При сравнении показателей липолитики ex vivo по генотипам используйте два или три образца на животное в качестве технических реплик и используйте среднее значение для одной точки данных на животное, чтобы размер выборки был равен количеству животных. Затем выполните статистический анализ данных.
Продукция FFA и глицерина в дифференцированных преадипоцитах in vitro была линейной во время четырехчасового анализа. Стимулированные липолитические показатели были значительно выше, чем базальные. В стимулированных клетках молярное отношение FFA к глицерину составляло около трех, что указывает на триглицеридный липолиз без значительного обратного захвата или удержания.
В нестимулированных клетках соотношение составляло около единицы, что указывает на нелиполитический источник глицерина. В культурах ex vivo более крупные куски ткани, имеющие более низкое отношение площади поверхности к объему, демонстрировали более высокое удержание FFA, что приводило к более низкому молярному отношению FFA-к глицерину. В 25-миллиграммовых кусках ткани удержание СЖК отрицательно влияло на скорость липолиза.
Очень крошечные куски ткани также показали сниженные липолитические показатели. Снижение содержания БСА в средах значительно снижало высвобождение как СЖК, так и глицерина. Накопление FFA в среде 5% BSA после 24-часовой стимуляции составляло пять миллимоляров, в то время как накопление 0,5% среды BSA составляло всего 0,6 миллимоля.
Уровни СЖК в собранных средах достигали опасной зоны 2,3 миллимоляра за три часа. Отсутствие увеличения СЖК и глицерина в средах через четыре часа предполагало ингибирование обратной связи. Исключение четырехчасовой временной точки вызвало небольшой, но значительный рост скорости выпуска.
Скорость высвобождения FFA была линейной даже между обычными временными точками. При удалении среды из образцов липолиза ex vivo важно убедиться, что кусочки ткани случайно не удалены пипеткой. Может потребоваться измерение содержания белка или липидов в этих образцах, чтобы должным образом нормализовать результаты.
