Митохондриальный метаболизм является важным регулятором прочности и памяти Т-клеток. Таким образом, измерение митохондриального дыхания дает важное представление о свойствах Т-клеток. Машина Seahorse может измерять различные элементы митохондриального дыхания в режиме реального времени в живых первичных Т-лимфоцитах человека без необходимости какой-либо маркировки.
Этот метод очень подходит для мониторинга пригодности Т-клеток и потенциала памяти, которые являются важными предикторами успеха иммунотерапии рака. Для начала промыть шарики CD3/CD28, перенеся 12,5 микролитра бусин на миллион клеток в микроцентрифужную трубку и добавив 12,5 микролитра PBS на 12,5 микролитра шариков в трубке. Затем поместите трубку микроцентрифуги на подходящий магнит на одну минуту, отбросьте буфер и повторно суспендируйте шарики в исходном объеме Т-клеточной среды.
Затем добавьте 12,5 микролитров бусин на миллион клеток в соотношении от одного до двух бусин к клеткам и разделите ячейки на два состояния с примерно пятью миллионами клеток в каждой. Затем добавьте правильный объем цитокинов к каждому состоянию и перенесите клетки в многолуночные пластины. Инкубируйте клетки в течение трех дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
После трех дней инкубации готовят свежую Т-клеточную среду с удвоенной концентрацией цитокинов. Повторное суспендирование и расщепление клеток путем переноса половины объема из каждой скважины в новую лунку. Затем добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежеприготовленной Т-клеточной среды.
Для внеклеточного флюса готовят раствор покрытия, содержащий бикарбонат натрия, Cell-Tak и гидроксид натрия. Затем откройте свежую пластину для культивирования клеток XF и добавьте 12 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия в каждую лунку, обеспечив равномерное распределение раствора покрытия на дне всех скважин. Инкубировать пластину при комнатной температуре с крышкой в течение 30 минут.
Затем выбросьте оставшийся жидкий раствор из всех колодцев. Вымойте пластину 200 микролитрами стерильной воды и выбросьте жидкость. Затем промыть пластину 200 микролитрами стерильного PBS клеточного культурального класса.
После выбрасывания жидкости дайте тарелке высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре. Чтобы наложить Т-клетки на пластину культивирования клеток XF, подготовьте 50 миллилитров среды для анализа, смешивая подходящую среду XF RPMI с глюкозой, пируватом и глютамином в соответствии с экспериментальной установкой. Нагрейте подготовленную среду до 37 градусов Цельсия в инкубаторе, не регулируемом углекислым газом, и установите рН на 7,4.
Обеспечьте достаточное количество сред для посадки клеток и приготовления растворов олигомицина и FCCP. Затем разработайте макет пластины с увеличением количества ячеек на скважину для оптимизации или прогона анализа. Используйте четыре скважины, заполненные средой и закачанные средой для фоновых измерений.
После подсчета Т-клеток, приготовленных ранее, пипеткой распределяют соответствующее количество клеток к каждой лунке ранее покрытой пластины для культивирования клеток XF в соответствии с расположением пластины. Чтобы приклеить Т-клетки к покрытой поверхности, центрифугируйте пластину культуры клеток XF. Затем промыть клетки 200 микролитрами пробирной среды.
Отбросьте носитель и добавьте 180 микролитров свежей пробирной среды. Убедившись, что клетки прикреплены и равномерно распределены по поверхности скважины, инкубируйте пластину культуры клеток XF при 37 градусах Цельсия в нагревательном шкафу без углекислого газа в течение 30 минут. Для оптимизации запуска подготовьте рабочие растворы олигомицина и FCCP в пробирных средах.
Затем загрузите рабочие растворы олигомицина или FCCP в отверстия для инъекций картриджа датчика. Убедитесь, что ни одно отверстие для впрыска не содержит только воздух. Заполните все пустые порты пробирными носителями.
Затем удалите потенциальные пузырьки в отверстиях для инъекций, осторожно выбив края пластины на столе. Для проведения анализа приготовьте 20-микромолярный раствор антимицина А. Затем, в соответствии с компоновкой пластины, загрузите 20 микролитров олигомицина или FCCP в инъекционный порт A картриджа датчика и добавьте 22 микролитра антимицина A в инъекционный порт B всех скважин.
В репрезентативном запуске оптимизации олигомицина плато в скорости потребления кислорода, или OCR, достигается, когда аккумулятивная концентрация достигает одного микромоля. Начиная с этой концентрации, OCR не уменьшался дальше. Для клеток, получавших повышенные концентрации разъединителя FCCP, уровни OCR увеличивались до 0,2 микромолярного FCCP, а затем достигали плато, что указывает на получение полного разъединения.
В репрезентативном запуске оптимизации концентрации клеток начальный OCR для прогона с 200 000 клеток составляет примерно половину от этого, с 400 000 клеток. После лечения FCCP максимальный OCR составляет 61,6 пикомолей в минуту для 200 000 клеток и 190,4 пикомолей в минуту для 400 000 клеток. После лечения олигомицином OCR в беге с 200 000 клеток сворачивается в однозначные цифры и ниже, чем в беге с 400 000 клеток.
Исследование влияния цитокинов интерлейкина-2 и интерлейкина-15 на метаболизм Т-клеток выявило, что культивируемые интерлейкин-15 клетки обладали более высоким максимальным дыханием и запасной дыхательной способностью. Однако базальное дыхание и выработка АТФ не пострадали. Изучение митохондриального метаболизма в Т-клетках человека дает важные подсказки об их долговечности и потенциале выживания.
Это приводит к расширению знаний о пригодности Т-клеток и может в конечном итоге улучшить показатели ответа на иммунотерапию рака.
