Этот протокол представляет если таков простой анализ цитометрии потока, позволяющий измерять митохондриальный мембранный потенциал и митохондриальную массу в живых клетках. Стандартные метаболические анализы терпят неудачу при работе с редкими популяциями, такими как гематопоэтические стволовые клетки. Этот метод позволяет пользователям митохондриального профилирования мембран при работе с низким количеством клеток и определить новые метаболические модуляторы клеток, таких как HSCs.
Кроме того, вы можете объединить его с вниз по течению функциональных анализов, таких как трансплантация костного мозга или колонии формирования анализов для определения функциональности ваших клеток пост-культуры. Наша техника может быть использована для выявления новых молекул, способных улучшить функцию HSC в контексте трансплантации костного мозга и гематопоэтического иммунного восстановления после абляционной терапии. Как описано в нашем протоколе, наш метод может быть использован для оценки метаболической пригодности иммунных Т-клеток.
Очень важно, чтобы клетки имеют минимальное воздействие света после окрашивания. Кроме того, использование ингибитора насоса verapamil должны быть включены для того, чтобы оценить вклад насоса эффлюкса. Тем не менее, пользователи должны знать, что верапамил глубоко возмущает ионическое равновесие и не может быть использован для оценки влияния метаболического модулятора на митохондриальный мембранный потенциал.
Визуальная демонстрация этого метода чрезвычайно важна, потому что есть некоторые важные шаги, которые нужно иметь в виду при работе с низким количеством ячеек, и эти шаги очень часто отсутствуют в обычных документах, которые пользователи читают на PubMed. Для сортировки FAC определяется популяция LKS, определяемая отрицательными линиями, Sca1 положительными, cKit-положительными. Гематопоэтические стволовые клетки от 5 до 10% клеток в популяции LKS идентифицируются путем gating для CD150 положительные, CD48 отрицательной популяции, помечены как HSCs.
После сортировки гематопоэтических стволовых клеток, Центрифуга труб при 300 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Аккуратно удалите большую часть супернатанта, не вытеснив гранулы, и оставьте от 50 до 80 микролитров поверх клеточной гранулы. Повторное распространение клеточных гранул в среде расширения стволовых клеток до конечного объема 200 микролитров.
Подготовка стерильной культуры ткани лечение 96 U-дно хорошо пластины, и определить колодцы, где клетки будут культурны. Передача 100 микролитров 2x базальной среды, ранее подготовленной в этих скважинах. В NR отмечены хорошо, добавить два микролитера 100x никотинамид рибозидный раствор.
Передача 100 микролитров 2x базальной среды в скважины для контроля окрашивания. Семя 100 микролитров подготовленных гематопоэтических стволовых клеток на верхней части скважин, содержащих 2x базальной среды. Семена 100 микролитров целых клеток костного мозга на скважинах отмечены как окрашивание элементов управления.
Добавьте 200 микролитров автоматической воды во все окружающие скважины, чтобы уменьшить испарение из колодцев, содержащих клетки. Поместите пластину спокойно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 72 часов. Вынул тарелку, чтобы пополнить никотинамид рибозид каждые 24 часа, и положил его обратно в инкубатор.
В конце периода культуры добавьте два микролитера 100x TMRM раствора и два микролитера 100x зеленого флуоресцентного раствора пятна в каждой из испытательных скважин. Добавьте два микролитров 100x TMRM в TMRM окрашивания управления хорошо. Добавить два микролитров 100x зеленый флуоресцентные пятна в MitoTracker окрашивания контроля хорошо.
Обложка верхней части пластины с алюминиевой фольгой. и поместите пластину обратно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 45 минут. Удалить пластину из инкубатора, и центрифуга его в 300 раз г в течение пяти минут.
Переверните пластину, чтобы удалить супернатант, и добавьте 200 микролитров стандартного буфера FACS для повторного перерасхода. Накройте тарелку фольгой. Центрифуга пластины в 300 раз г в течение пяти минут.
Повторите этот шаг стирки три раза. Повторное использование ячеек в 200 микролитров буфера FACS и передача в трубки FACS. Для запуска образцов на цитометре потока сначала загрузите элементы управления одним цветом в машину и замечьте не менее 5 000 событий в каждом по одному.
В программном обеспечении нажмите Acquire, а затем завестите на приборной панели, чтобы приобрести и записать одиночные элементы управления цветом. Нажмите Компенсационая настройка и нажмите Рассчитайте компенсацию для расчета компенсации. После того, как компенсация была применена, приобрести образец гематопоэтических стволовых клеток, и записывать как можно больше событий, как это возможно.
Экспорт файлов FACS из цитометра, и открыть файл на анализ программного обеспечения. На FlowJo используйте вперед рассеяние и боковые рассеяния gating для идентификации популяции ячейки. Определите синглеты в следующих воротах, а затем навемит отрицательную фракцию DAPI, представляющую живые ячейки.
В живых клеточных ворот, сделать контурный участок в TMRM и зеленый флуоресцентный канал пятна для измерения митохондриальной мембраны потенциал и массу, соответственно. Экспорт средняя интенсивность флуоресценции этих двух каналов в живых ворот ячейки. Затем экспорт доли ячеек в низких воротах TMRM во всех образцах.
Никотинамид рибозид лечение показало явное увеличение ТМРМ низкой популяции. Он также значительно увеличил долю клеток в низких воротах TMRM и показал значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM. Митохондриальная масса не меняться при никотинамиде рибозидных добавок.
Кроме того, окрашивание маркеров стволовых клеток было объединено с митохондриальным окрашиванием пост-культуры. С gating стратегии для выявления гематопоэтических стволовых клеток, воздействие никотинамида рибозид показал значительное увеличение ТМРм низкой популяции и значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM в закрытых HSCs. Зеленый флуоресцентный митохондриальный пятно зеленый сигнал остался неизменным в двух условиях.
Важно, чтобы покрыть окрашивание пластины алюминиевой фольгой, с тем чтобы свести к минимуму воздействие света на окрашенные образцы. Этот метод может быть объединен с вниз по течению анализы, такие как трансплантация костного мозга и колонии формирования анализов для определения функциональности стволовых клеток. Таким образом, этот метод позволяет простой метод скрининга для выявления новых метаболических модуляторов HSCs.
