Этот протокол использует автоматизацию для выполнения препаратов биохимии белка до экспериментов масс-спектрометрии, что обеспечивает более высокую пропускную способность и более низкую вариабельность для протеомных исследований. Этот протокол использует недорогую, программируемую систему обработки жидкостей, которая доступна большему количеству лабораторий. Мы предоставляем скрипты Python с открытым исходным кодом, которые могут быть изменены для дальнейшей разработки.
Продемонстрировать процедуру будет Милтон Амайя, студент магистратуры в нашей лаборатории. Для начала откройте noSP3_Digestion. скрипт py в текстовом редакторе и укажите переменные, специфичные для эксперимента, по мере необходимости в разделе НАСТРОИТЬ ЗДЕСЬ ТОЛЬКО.
Затем откройте приложение Opentrons и загрузите сценарий на вкладку Протокол в приложении Opentrons. Затем поместите необходимые лабораторные изделия и пипетки в соответствующее место в колоде OT2, указанной в скрипте Python. Затем поместите раствор бикарбоната аммония в скважину А1 трубчатой стойки «четыре в одном» с верхней частью держателя трубки объемом 15 миллилитров плюс 50 миллилитров и поместите образец белка в колодец формата А1 стойки для трубок «четыре в одном» с двухмиллилитровой крышкой держателя трубки.
Вручную поместите двухмиллилитрные белковые трубки с низким связыванием в колодцы алюминиевого блока, размещенного поверх температурного модуля, начиная с А1 и двигаясь вниз по вертикали. Затем поместите раствор DTT в колодец A6 трубчатой стойки «четыре в одном» с двухмиллилитровой крышкой держателя трубки. Наблюдайте, как робот передает соответствующий объем буфера бикарбоната аммония в пробоотборники в алюминиевом блоке.
Затем вручную убедитесь, что программа робота приостановлена, и отобразите сообщение: Убедитесь, что DTT был загружен в A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. После подтверждения местоположения трубки DTT и открытия крышки трубки нажмите кнопку «Возобновить» в приложении Opentrons, чтобы продолжить. Убедитесь, что робот передает 10 микролитров раствора DTT в каждую пробную скважину, а затем пять раундов смешивания.
Затем убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что крышки закрыты на пробках. Затем вручную закройте крышки трубок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока температурный модуль робота не начнет нагревать алюминиевый блок, и температура достигнет 55 градусов по Цельсию, а затем пятиминутная инкубация, чтобы позволить образцам достичь 55 градусов по Цельсию.
Затем робот будет удерживать эту температуру в течение 30 минут, чтобы обеспечить снижение белка с помощью DTT. Во время инкубации приготовьте раствор йодоацетамида и вручную оберните его алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. После инкубации, когда программа робота приостановлена и отображает предупреждающее сообщение, убедитесь, что вы открыли колпачки на пробках, снимите крышку пробирок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
Затем вручную убедитесь, что программа робота приостановлена с предупреждающим сообщением, убедитесь, что йодоацетамид был загружен в B6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. После подтверждения местоположения в стойке трубки йодоацетамида и открытия крышки трубки нажмите «Возобновить» и убедитесь, что робот передает 10 микролитров раствора йодоацетамида в каждую пробирку для образцов, а затем пять раундов смешивания. Когда программа робота приостановлена и отображает сообщение, закройте крышки на пробках, закройте пробки и накройте их фольгой, затем накройте весь алюминиевый блок чистым куском фольги и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
Подождите, пока образцы не будут инкубированы при температуре 22 градуса Цельсия в течение 30 минут, и убедитесь, что температурный модуль робота деактивируется по завершении инкубации йодоацетамида. Когда программа робота приостановлена и отображает предупреждающее сообщение, убедитесь, что трипсин был загружен в C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, перед возобновлением протокола, поместите раствор трипсина в колодец C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Затем, когда программа робота приостанавливается и отображает предупреждающее сообщение, откройте колпачки на пробках на температурном модуле, снимите крышку пробирок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
В режиме ожидания робот передает 10 микролитров трипсина в каждую пробку, а затем пять раундов смешивания. После ночного переваривания трипсина кратковременно раскрутите образцы с помощью настольной микроцентрифуги и поместите образцы на стойку с магнитной трубкой. Через две минуты аккуратно перенесите супернатант пипеткой в новый набор белковых микроцентрифуг с низким связыванием и храните образцы в холодильнике.
Затем откройте SP3_peptide_cleanup. скрипт py Python в текстовом редакторе и укажите переменные эксперимента по мере необходимости в разделе НАСТРОИТЬ ЗДЕСЬ ТОЛЬКО. Затем загрузите скрипт на вкладку Протокол в приложении Opentrons.
Поместите необходимую лабораторную посуду и пипетки в соответствующее место в колоде OT2, указанной в скрипте Python, и убедитесь, что магнитный модуль включен и подключен к роботу. Поместите новую двухмиллилитровую пластину скважины глубиной 96 лунок на верхнюю часть магнитного модуля. Затем поместите переваренные образцы в двухмиллилитровую трубчатую стойку, начиная с формата А1 и двигаясь вниз по вертикали.
Затем обеспечить передачу роботом 55 микролитров переваренных образцов в скважины в глубоких пластинах скважин на магнитном модуле. Убедитесь, что протокол робота приостановлен и отображает сообщение, Убедитесь, что подготовленные бусины были загружены в A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. Затем вихрь и кратковременно раскрутите бусины SP3 в мини-настольной центрифуге и поместите их в колодец A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой.
Убедитесь, что программа роботов приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что 80% этанола было загружено в A4 15-миллилитра плюс 50-миллилитровая трубчатая стойка, расположенная в пятом слоте, до возобновления протокола. Затем поместите 80%-ный раствор этанола в скважину A4 в стойке трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Наблюдайте, как робот изменяет скорость пипетки на медленную, аспирирует супернатант из каждой скважины и распределяет его в отработанную трубу.
Подождите, пока робот не изменит скорость пипетки обратно на стандартную и отключит магнитный модуль. Когда программа роботов приостановлена и отображает сообщение, откройте крышку на бикарбонатной трубке аммония, откройте крышку раствора бикарбоната аммония, затем нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. В режиме ожидания робот отключает магнитный модуль, передает 250 микролитров буфера бикарбоната аммония в каждую скважину и сразу же перемешивается в течение 10 раз.
Затем наблюдайте, как робот изменяет скорость пипетки на медленную и переносит супернатант из каждой скважины в отработанную трубу. Подождите, пока робот перенесет 100 микролитров буфера бикарбоната аммония в каждую скважину и сразу же перемешает 10 раз. Убедитесь, что программа роботов приостановлена и отображает сообщение, Убедитесь, что новые трубки сбора были помещены в двухмиллилитровой алюминиевый блок перед возобновлением протокола.
Затем поместите новый набор микроцентрифужных трубок с низким удержанием белка в алюминиевый блок сразу после последней пробы, первоначально находящейся в блоке, и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. В режиме ожидания робот передает каждый образец в буфере бикарбоната аммония в новые двухмиллилитрные трубки. Когда программа робота приостановлена и отображает сообщение, убедитесь, что трипсин был загружен в C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, перед возобновлением протокола, поместите раствор трипсина в колодец C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.
Как только программа будет завершена, оберните крышки пробирки парафиновой пленкой, перенесите все образцы в смеситель с контролируемой температурой и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 16-20 часов с встряхиванием 1000 оборотов в минуту. С образцом BSA была идентифицирована среда из 728 совпадений пептидного спектра и 65 пептидов с коэффициентами вариации 5,2% и 3,2% соответственно. Со сложным образцом сердца среда из 9 526 совпадений пептидного спектра, 7 558 пептидов и 1 336 белков была идентифицирована в 10 прогонах с коэффициентами вариации 7,6% 5,9% и 3,6% соответственно.
Для определения изменчивости количественной оценки пептидов были рассчитаны коэффициенты вариации интенсивности экстрагированной ионной хроматограммы для 10 пептидов, которые сопоставляются с уникальным белком. Когда вариации экспериментальных результатов человека и робота в измерении концентрации белка были дополнительно сопоставлены с анализом BCA, средний коэффициент вариации анализа BCA робота был ниже, чем ручной анализ BCA человека. Этот протокол сокращает время стенда для обработки каждого образца.
Это прокладывает нам путь к изучению протеомических различий в панели клеточных линий между несколькими лекарственными препаратами.
