Представленный протокол позволяет количественно оценить широкий спектр липидов в тканях животных. Это простой инструмент для изучения липидных механизмов, а также для выявления биомаркеров, указывающих на раннюю токсичность на животных моделях. Метод обеспечивает количественный профиль более 400 молекулярных липидов в 14 различных классах липидов в широком спектре матриц образцов с 10-минутным временем тренда на образец.
Для начала разбавьте надосадочную жидкость центрифугой аликвот 1 в два раза больше концентрации буфером из бикарбоната аммония. После приготовления стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина переверните стандартные пробирки и центрифугируйте пробирки при 18, 200 г в течение 15 секунд при комнатной температуре. Из стандартных пробирок, подготовленных ранее, перенесите по 6 микролитров каждой заготовки, стандартов и образцов на 96-луночную пластину с плоским дном.
Затем добавьте 250 микролитров реагента Брэдфорда в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и перемешайте. После инкубации в течение 5 минут измерьте поглощение на длине волны 595 нанометров с помощью планшетного считывателя. Подготовьте 2 миллилитровые пробирки со 100 микролитрами раствора бикарбоната аммония в каждую пробирку общей заготовки и внутренней стандартной заготовки и храните все образцы на льду.
Подготовьте образцы контроля качества, учитывая, что один образец контроля качества помещается между каждым набором из 10 образцов. Добавьте 10 микролитров объединенной человеческой плазмы в 2-миллилитровые пробирки, затем добавьте 10 микролитров внутреннего стандартного раствора во все внутренние стандартные заготовки, образцы контроля качества и исследования. Добавьте 300 микролитров смеси бутанола и метанола минус 20 градусов Цельсия к каждому образцу и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксе.
Затем добавьте 300 микролитров смеси гептана этилацетата и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем добавьте 300 микролитров 1%-ной смеси аскетической кислоты и взбалтывайте в течение 5 минут при 450 г при комнатной температуре на термомиксере. Центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре и перелить 360 микролитров верхней фазы в новую 2-миллилитровую самоблокирующуюся пробирку с маркировкой 2. После добавления 320 микролитров гептанэтилацетата в пробирку водной фазы, помеченную как 1, встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, как показано ранее.
Перенесите 320 микролитров верхней фазы и соедините их с фракцией из предыдущего шага в пробирку 2. Аналогичным образом добавьте 250 микролитров гептанэтилацетата в водную фазу в пробирке 1 и встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере. Снова центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, затем переносят 200 микролитров верхней фазы и соединяют ее с фракциями из предыдущих этапов в пробирке 2.
Выпарить досуха при 35 градусах Цельсия в вакуумном концентраторе и повторно растворить в 300 микролитрах раствора смеси МС. Встряхните каждую пробирку в течение 5 секунд, чтобы убедиться, что все растворилось, и центрифугу при 18, 200 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Перенесите аликвоту 50 мкл в микролитровую пластину для анализа режима положительной ионизации и разбавьте 50 микролитрами раствора смеси МС.
Опять же, разбавьте 80 микролитрами смеси MS и перенесите аликвоту из 20 микролитров в пластину MTP для анализа режима отрицательной ионизации. Оберните тарелку фольгой и держите при температуре 4 градуса Цельсия перед анализом. Калибруйте МС как в положительном, так и в отрицательном режимах в соответствии с инструкциями производителя не более чем за 5 дней до анализа.
Установите наноисточник прямой инфузии заранее, убедившись, что он правильно выровнен по переносному капилляру MS и чипу сопла 4,1 микрометра в держателе чипа, затем проверьте параметры положительной и отрицательной инфузии, соответствующие давлению газа 1,25 фунта на квадратный дюйм, напряжение источника 1,1 киловольта, 5 микролитров объема впрыска образца, выход контакта замыкания Rel1 на 2,5 секунды, 5 минут времени подачи, охлаждение пластины при 4 градусах Цельсия, затем настройка регулятора температуры и создание новой пластины. Для положительного режима проверьте и настройте программное обеспечение, которое настроено на метод MS с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия и уровнем RF объектива S на уровне 65,0. В программном обеспечении Xcalibur откройте положительный метод и убедитесь, что полное сканирование MS установлено от нуля до 1 минуты в диапазоне от 550 до 1 000 м/з при разрешении 140 000 с автоматической регулировкой усиления 1 миллион и максимальным временем впрыска 50 миллисекунд.
Применим замок массой 680.48022. Убедитесь, что независимый от данных метод сбора данных MS/MS настроен в диапазоне времени от 1 до 5 минут с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 250 м/z. Убедитесь, что автоматическая регулировка усиления для MS2 настроена на 100 000, а максимальное время впрыска - на 64 миллисекунды, энергия столкновения - 20 NCE, изолирующее окно - на 1 m/z и что используется список масс включения от 398 до 1 100 м/z с шагом массы 1 Дальтон.
Для сбора данных в отрицательном режиме проверьте в программном обеспечении настройки, что метод MS настроен с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия на уровне RF объектива S-lens на уровне 65.0 в файле настройки MS. Затем в программном обеспечении Xcalibur убедитесь, что режим сбора данных с полным сканированием настроен от нуля до 1 минуты с разрешением 140 000, охватывающим диапазон от 400 до 940 м/з, автоматическая регулировка усиления 1 миллион, максимальное время впрыска 200 миллисекунд и масса блокировки 526,46262. Убедитесь, что сбор данных MS2 в режиме DIA настроен между 1 и 5 минутами прогона с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 150 м/з, автоматической регулировкой усиления 100 000, 64 миллисекунды максимального времени впрыска и 35 NCE энергии столкновения с использованием списка масс включения от 400 до 940 с шагом массы 1 Дальтон.
Создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в положительном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока сбор образца будет инициирован сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Когда анализ положительного режима завершен, создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в отрицательном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока захват образца будет запущен сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Общая нормализованная концентрация липидов была идентифицирована и количественно определена из 14 наиболее распространенных классов липидов, которая была немного повышена для классов липидов PE, PEO, PC, PCO, PI и PG, и некоторое снижение регуляции наблюдалось для липидов SM, LPE и PA.
В то время как никакой разницы не было видно для тегов и PS. Эти результаты также показывают, что среди молекулярных особенностей, основанных на общей молекулярной формуле, от 100 до 120 соединений были значительно затронуты воздействием сигаретного дыма. Деконволюция фрагментации MS2 и нормализация интенсивности сигнала фрагмента позволили приблизительно определить общее количество каждой конъюгированной жирной кислоты, представленной в каждом липидном стакане, и сравнить эти данные между группами, подвергшимися воздействию, и контрольной группой. Наблюдалось снижение полностью насыщенных и ненасыщенных ненасыщенных жирных кислот, тогда как полиненасыщенные жирные кислоты в составе классов фосфолипидов PC, PE и PG были повышены в группе сигаретного дыма за все моменты времени.
Крайние случаи ПК и ПГ, конъюгированные с эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислотой, были выявлены исключительно в группе воздействия 3R4F CS. Пипетирование образца и образца контроля качества должно выполняться с помощью низкочастотных наконечников и быть точным, то есть наконечники должны проверяться между каждым образцом. Пипетирование внутреннего стандартного решения имеет решающее значение и должно быть точным.
С раствором 1-1 дихлорметан-метанола следует обращаться осторожно, и следует использовать наконечники, не содержащие пластификатор, чтобы избежать попадания пластиковых полимеров в образцы. Наконечники необходимо менять между каждыми образцами.
