Было показано, что анализ протрузии края клетки напрямую коррелирует с миграцией клеток. Поэтому его можно использовать в качестве предварительного метода идентификации критических белков и сигнальных механизмов, участвующих в подвижности клеток. Метод быстрый, простой, экономичный и не требует флуоресцентной маркировки или использования дорогостоящего флуоресцентного микроскопа.
Продемонстрировать процедуру будет Михал Гендлер, студент из моей лаборатории. Добавьте два миллилитра одного обычного раствора соляной кислоты в центр стеклянной донной посуды и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Трижды вымойте посуду двумя миллилитрами PBS.
Развести фибронектин при концентрации 10 мкг на миллилитр в PBS и добавить 200 микролитров разбавленного раствора в стеклянную центральную посуду. Инкубировать в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Приготовьте 1% раствор BSA и PBS и пропустите его через фильтр 0,2 микрометра.
Денатурируйте раствор путем инкубации при 70 градусах Цельсия в течение 30 минут на предварительно подогретой водяной бане. Трижды вымойте стеклянную нижнюю посуду двумя миллилитрами PBS. Добавьте два миллилитра денатурированного раствора BSA и инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Трижды вымойте стеклянную посуду двумя миллилитрами PBS. Перед 16 - 18 часами эксперимента при 0,7 миллионах клеток на 10 сантиметров диаметром тканевой культуральной пластины достигается от 70 до 80% конфюлюзии. На следующий день добавьте два миллилитра раствора трипсина в тканевую культуральную пластину и инкубируйте в течение двух-трех минут, пока клетки не отделятся.
Добавьте пять миллилитров среды, чтобы инактивировать трипсин. Используя гемацитометр, подсчитайте ячейки и пластину 20 000 клеток в двух миллилитрах полной среды в нижней чашке. Затем высиживают блюдо с позолоченными клетками в инкубаторе в течение 15 минут.
Включите нагревательный блок и установите его на 37 градусов цельсия за час до получения изображения. Кроме того, включите блок углекислого газа и установите его на 5% за 10 минут до визуализации. Включите микроскоп и камеру.
Включите компьютер и откройте программное обеспечение для сбора микроскопа. Установите увеличение на 40-кратный фазовый контраст сухого объектива. Установите общую продолжительность фильма на 10 минут с интервалом времени в пять секунд.
После 15 минут инкубации поместите стеклянную нижнюю посуду с приклеенными клетками в адаптер и зафиксируйте ее. Вставьте адаптер с тарелкой в пазы на ступени микроскопа. Снимите крышку тарелки, поместите крышку углекислого газа и откройте клапан углекислого газа.
Найдите подходящую ячейку для визуализации. Начните сбор фильма, сосредоточившись на клетке. Для выполнения анализа изображения выберите прямой инструмент в программном обеспечении для анализа изображений и сделайте восемь линий из 20 произвольных единиц, перпендикулярных выступам в радиальном расположении через каждые 45 градусов, включая ламели и край ячейки.
На главной панели инструментов перейдите к изображению, выберите Стеки, а затем щелкните Reslice, чтобы сгенерировать изображение кимографа, описывающее движение отдельных точек внутри клеточной мембраны. Используя изображения кимографа, извлеките и вручную подсчитайте количество выступов, втягиваний и оборок в каждой из восьми областей ячейки, отмеченных линиями сетки. Эти цифры представляют частоту протрузий, втягиваний и оборок за 10 минут.
Определение стойкости протрузии, расстояния и скорости с помощью кимографического анализа. Чтобы определить расстояние протрузии, проведите перпендикулярную линию от основания выступа до самой высокой вершины протрузии. Нажмите клавишу M, чтобы измерить длину линии в пикселях и убедиться, что отношение пикселей к микрометру преобразует длину в микрометрах.
Количественную оценку протрузий, реакций и оборок проводили вручную за 10 минут, а средняя частота, полученная для протрузий и втягиваний, составляла 5,1 и 2,1 для оборок. Представительский кимограф имел расстояние протрузии приблизительно 4,8 микрометра и время протрузии приблизительно 0,6 минуты. Приведен пример ячейки, которую следует исключить из анализа.
Кимографический анализ показал, что клетка не присутствовала в фазе своего распространения и не показала каких-либо явных выступов мембраны. Самое главное – правильно подобрать клетки для визуализации. Правильная клетка должна находиться в фазе распространения и не должна касаться других клеток, чтобы избежать клеточной связи и передачи сигналов.
Метод может быть использован в качестве предварительного инструмента для тестирования динамики цитоскелета, включающей подвижность клеток, прежде чем принять решение о выполнении более результатов, требующих анализов миграции клеток.
