세포-가장자리 돌출 분석은 세포 이동과 직접적으로 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서 세포 운동성에 관여하는 중요한 단백질 및 신호전달 메카니즘을 확인하기 위한 예비 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하며 비용 효율적이며 형광 표지 또는 고가의 형광 현미경을 사용할 필요가 없습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 학생 인 Michal Gendler가 될 것입니다. 유리 바닥 접시의 중앙에 하나의 일반 염산 용액 2 밀리리터를 넣고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. PBS 두 밀리리터로 접시를 세 번 씻으십시오.
PBS에서 밀리리터 당 10 마이크로그램의 농도로 피브로넥틴을 희석하고 희석된 용액 200 마이크로리터를 유리 중앙 접시에 첨가한다. 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양하십시오. 1%BSA 용액과 PBS를 준비하고 0.2마이크로미터 필터를 통과시킨다.
용액을 미리 예온된 수조에서 섭씨 70도에서 30분 동안 인큐베이션하여 변성시킨다. 코팅 된 유리 바닥 접시를 PBS 두 밀리리터로 세 번 씻으십시오. 변성 BSA 용액 두 밀리리터를 넣고 한 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오.
유리 접시를 PBS 두 밀리리터로 세 번 씻으십시오. 16 내지 18시간 전에 10 센티미터 직경의 조직 배양 플레이트 당 0.7 백만 개의 세포에서 실험하여 70 내지 80%컨플루언시를 달성하였다. 다음날, 두 밀리리터의 트립신 용액을 조직 배양 플레이트에 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 두세 분 동안 배양한다.
트립신을 비활성화하기 위해 배지 다섯 밀리리터를 추가하십시오. 혈구측정기를 사용하여, 세포와 플레이트 20, 000 세포를 바닥 접시에서 완전한 배지의 2 밀리리터에 계수한다. 그 다음 플레이팅된 세포와 함께 접시를 15분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
이미징하기 한 시간 전에 가열 장치를 켜고 섭씨 37도에서 설정하십시오. 또한 이산화탄소 장치를 켜고 이미징 전에 5%10%로 설정합니다. 현미경과 카메라를 켭니다.
컴퓨터를 켜고 현미경 수집 소프트웨어를 엽니다. 배율을 40X 드라이 렌즈 위상 대비로 설정합니다. 총 동영상 지속 시간을 10분으로 설정하고 시간 간격은 5초입니다.
15 분 동안 배양 한 후, 부착 된 세포가있는 유리 바닥 접시를 어댑터에 넣고 고정하십시오. 접시가있는 어댑터를 현미경 단계의 슬롯에 삽입하십시오. 접시 덮개를 벗고 이산화탄소 뚜껑을 놓고 이산화탄소 밸브를 엽니 다.
이미징에 적합한 셀을 찾습니다. 셀에 초점을 맞춘 후 동영상 수집을 시작합니다. 이미지 분석을 수행하려면 이미지 분석 소프트웨어에서 직선 도구를 선택하고 라멜라 및 셀 가장자리를 포함하여 45도마다 방사형 배열로 돌출부에 수직인 20개의 임의의 단위로 구성된 여덟 줄을 만듭니다.
기본 도구 모음에서 이미지로 이동하여 스택을 선택한 다음 Reslice를 클릭하여 세포막 내의 단일 점의 이동을 설명하는 키모그래프 그림을 생성합니다. 키모그래프 이미지를 사용하여, 격자선으로 표시된 셀의 여덟 영역 각각에서 돌출부, 수축 및 주름의 수를 추출하고 수동으로 계수합니다. 이 숫자는 10 분 당 돌출부, 수축 및 주름의 빈도를 나타냅니다.
돌출 지속성, 거리 및 속도를 kymography 분석으로 결정합니다. 돌출 거리를 결정하려면 돌출부의 바닥에서 돌출부의 가장 높은 피크까지 수직 선을 그립니다. M을 눌러 선의 길이를 픽셀 단위로 측정하고 픽셀 대 마이크로미터 비율이 길이를 마이크로미터 단위로 변환하는 것으로 알려져 있는지 확인합니다.
돌출부, 반응 및 프릴의 정량화는 10분마다 수동으로 수행되었으며, 돌출부 및 굴절에 대해 얻어진 평균 빈도는 프릴의 경우 5.1 및 2.1이었다. 대표적인 키모그래프는 약 4.8마이크로미터의 돌출 거리와 약 0.6분의 돌출 시간을 가졌다. 분석에서 제외되어야 하는 셀의 예가 표현된다.
kymography 분석은 세포가 확산 단계에 존재하지 않았으며 명확한 막 돌출부를 나타내지 않았다는 것을 밝혀 냈습니다. 가장 중요한 것은 이미징을 위해 올바른 세포를 선택하는 것입니다. 적절한 세포는 확산 단계에 있어야하며 세포 - 세포 통신 및 신호 전달을 피하기 위해 다른 세포를 만져서는 안됩니다.
이 방법은 세포 이동 분석을 요구하는 더 많은 결과를 수행하기로 결정하기 전에 세포 운동성을 포함하는 세포 골격 역학을 테스트하기위한 예비 도구로 사용될 수 있습니다.
