Es hat sich gezeigt, dass der Zellrand-Protrusionsassay direkt mit der Zellmigration korreliert. Daher kann es als vorläufige Methode zur Identifizierung kritischer Proteine und Signalmechanismen verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt sind. Die Methode ist schnell, einfach, kostengünstig und erfordert keine fluoreszierende Markierung oder Verwendung eines teuren Fluoreszenzmikroskops.
Das Verfahren wird Michal Gendler, ein Student aus meinem Labor, demonstrieren. Fügen Sie zwei Milliliter einer normalen Salzsäurelösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Geschirr dreimal mit zwei Millilitern PBS.
Verdünnen Sie Fibronektin bei 10 Mikrogramm pro Milliliterkonzentration in PBS und fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lösung in die Glasmittelschale hinzu. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie 1% BSA-Lösung und PBS vor und führen Sie es durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.
Denaturieren Sie die Lösung, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad inkubieren. Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Fügen Sie zwei Milliliter denaturierte BSA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Waschen Sie die Glasschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Vor 16 bis 18 Stunden Experiment bei 0,7 Millionen Zellen pro 10 Zentimeter Durchmesser Gewebekulturplatte, um 70 bis 80% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag zwei Milliliter Trypsinlösung in die Gewebekulturplatte geben und zwei bis drei Minuten inkubieren, bis sich die Zellen ablösen.
Fügen Sie fünf Milliliter des Mediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Zählen Sie mit einem Hämacytometer die Zellen und die Platte 20.000 Zellen in zwei Millilitern des gesamten Mediums in einer unteren Schale. Dann inkubieren Sie die Schale mit plattierten Zellen in einem Inkubator für 15 Minuten.
Schalten Sie das Heizgerät ein und stellen Sie es eine Stunde vor der Bildgebung auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie auch die Kohlendioxideinheit ein und stellen Sie sie auf 5% 10 Minuten vor der Bildgebung ein. Schalten Sie das Mikroskop und die Kamera ein.
Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen 40-fachen Trockenlinsenphasenkontrast ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Films auf 10 Minuten mit einem Zeitintervall von fünf Sekunden fest.
Nach 15 Minuten Inkubation die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in einen Adapter geben und fixieren. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in die Schlitze im Mikroskoptisch. Nehmen Sie den Schalendeckel ab, setzen Sie den Kohlendioxiddeckel auf und öffnen Sie das Kohlendioxidventil.
Suchen Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Beginnen Sie mit der Filmakquisition, nachdem Sie sich auf die Zelle konzentriert haben. Um die Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das gerade Werkzeug in der Bildanalysesoftware und machen Sie acht Linien von 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen in einer radialen Anordnung bei allen 45 Grad, einschließlich Lamelle und Zellkante.
Gehen Sie in der Hauptsymbolleiste zum Bild, wählen Sie Stacks und klicken Sie dann auf Reslice, um ein Kymographenbild zu erstellen, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt. Extrahieren und zählen Sie anhand der Kymographenbilder die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche in der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind, manuell und manuell. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 Minuten dar.
Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Um den Vorsprung zu bestimmen, zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M, um die Länge der Linie in Pixel zu messen und sicherzustellen, dass das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer bekannt ist, um die Länge in Mikrometer umzuwandeln.
Die Quantifizierung von Vorsprüngen, Reaktionen und Rüschen wurde manuell pro 10 Minuten durchgeführt, und die durchschnittliche Häufigkeit für Vorsprünge und Rückzug betrug 5,1 und 2,1 für Rüschen. Der repräsentative Kymograph hatte einen Protrusionsabstand von etwa 4,8 Mikrometern und eine Protrusionszeit von etwa 0,6 Minuten. Ein Beispiel für eine Zelle, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollte, wird dargestellt.
Die Kymographie-Analyse ergab, dass die Zelle in ihrer Ausbreitungsphase nicht vorhanden war und keine klaren Membranvorsprünge zeigte. Das Wichtigste ist, die richtigen Zellen für die Bildgebung auszuwählen. Eine richtige Zelle sollte sich in ihrer Ausbreitungsphase befinden und andere Zellen nicht berühren, um Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung zu vermeiden.
Die Methode kann als vorläufiges Werkzeug zum Testen der zytoskelettalen Dynamik mit Zellmotilität verwendet werden, bevor entschieden wird, mehr Ergebnisse durchzuführen, die Zellmigrationsassays erfordern.
