O ensaio de saliência de borda celular mostrou-se diretamente correlacionado com a migração celular. Portanto, pode ser usado como um método preliminar para identificar proteínas críticas e mecanismos de sinalização envolvidos na motilidade celular. O método é rápido, simples, econômico e não requer rotulagem fluorescente ou uso de um microscópio fluorescente caro.
Demonstrando o procedimento será Michal Gendler, um estudante do meu laboratório. Adicione dois mililitros de uma solução normal de ácido clorídrico no centro de uma placa de fundo de vidro e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave o prato três vezes com dois mililitros de PBS.
Diluir a fibronectina a 10 microgramas por concentração de mililitros na PBS e adicionar 200 microliters da solução diluída ao prato central de vidro. Incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Prepare a solução 1%BSA e a PBS e passe-a através de um filtro de 0,2 micrômetros.
Desnaturar a solução incubando a 70 graus Celsius por 30 minutos em um banho de água pré-aquecido. Lave o prato de fundo de vidro revestido com dois mililitros de PBS três vezes. Adicione dois mililitros de solução BSA desnaturadas e incubar o prato a 37 graus Celsius por uma hora.
Lave o prato de vidro com dois mililitros de PBS três vezes. Antes de 16 a 18 horas de experimento em 0,7 milhões de células por placa de cultura tecidual de 10 centímetros de diâmetro para alcançar 70 a 80% de confluência. No dia seguinte, adicione dois mililitros de solução de trippsina à placa de cultura tecidual e incubar por dois a três minutos até que as células se despeguem.
Adicione cinco mililitros do meio para inativar a trippsina. Usando um hemacitómetro, conte as células e a placa 20.000 células em dois mililitros do meio completo em um prato inferior. Em seguida, incubar o prato com células banhadas em uma incubadora por 15 minutos.
Ligue a unidade de aquecimento e coloque-a a 37 graus Celsius uma hora antes da imagem. Além disso, ligue a unidade de dióxido de carbono e coloque-a em 5%10 minutos antes da imagem. Ligue o microscópio e a câmera.
Ligue o computador e abra o software de aquisição de microscópio. Coloque a ampliação em um contraste de fase de lente seca de 40X. Defina a duração total do filme para 10 minutos com um intervalo de tempo de cinco segundos.
Após 15 minutos de incubação, coloque o prato de fundo de vidro com células aderidas em um adaptador e fixe-o. Insira o adaptador com o prato nas ranhuras no estágio do microscópio. Tire a tampa do prato, coloque a tampa de dióxido de carbono e abra a válvula de dióxido de carbono.
Localize uma célula apropriada para imagens. Comece a aquisição de filmes depois de se concentrar no celular. Para realizar a análise da imagem, selecione a ferramenta reta no software de análise de imagens e faça oito linhas de 20 unidades arbitrárias perpendiculares às saliências em um arranjo radial a cada 45 graus, incluindo lamella e borda celular.
Na barra de ferramentas principal, vá para a imagem, selecione Stacks e clique em Reslice para gerar uma imagem kymografia descrevendo o movimento de pontos únicos dentro da membrana celular. Utilizando as imagens de kymógrafo, extraia e contabiliza manualmente o número de saliências, retrações e babados em cada uma das oito regiões da célula marcada pelas linhas de grade. Esses números representam a frequência de saliências, retrações e babados por 10 minutos.
Determine a persistência de saliência, distância e velocidade por meio da análise da kymografia. Para determinar a distância de saliência, retire a linha perpendicular da base da saliência até o pico mais alto da saliência. Pressione M para medir o comprimento da linha em pixels e certifique-se de que a relação pixel/micrômetro é conhecida por converter o comprimento em micrômetros.
A quantificação de saliências, reações e babados foi realizada manualmente por 10 minutos e a frequência média obtida para saliências e retrações foi de 5,1 e 2,1 para babados. O kymograph representativo tinha uma distância de saliência de aproximadamente 4,8 micrômetros e um tempo de saliência de aproximadamente 0,6 minutos. Um exemplo de célula que deve ser excluída da análise é representado.
A análise da kymografia revelou que a célula não estava presente em sua fase de disseminação e não apresentava nenhuma saliência de membrana clara. O mais importante é escolher células corretas para imagens. Uma célula adequada deve estar em sua fase de disseminação e não deve tocar outras células para evitar a comunicação e sinalização celular-célula.
O método pode ser usado como uma ferramenta preliminar para testar a dinâmica citoesquelletal envolvendo motilidade celular antes de decidir realizar mais resultados exigindo ensaios de migração celular.
