Этот протокол описывает высокопроизводительный колориметрический анализ на трех этапах жизненного цикла Trypanosoma cruzi для выявления новых кандидатов на лекарства для болезни Шагаса. Это может быть использовано для идентификации трипаноцидных соединений простым, быстрым и воспроизводимым способом. Продемонстрировать процедуру будет Ромина Манарин, техник по лабораторным клеточным культурам из лаборатории колыбелы Памелы.
Начинают с культивирования бета-галактозидазы, экспрессирующей Trypanosoma cruzi epimastigotes в колбе культуры ткани Т-25 и инкубируют при 28 градусах Цельсия для выращивания их аксенически. Используя камеру Нойбауэра, количественно оцените рост паразита перед субкультурой. Для поддержания культур в логарифмической фазе субкультуру каждые 48 - 72 часа в пяти миллилитрах ЛИТ среды дополняют 10% FCS и генетикином в сульфате в конечной концентрации 200 мкг на миллилитр.
Затем надежно закройте колпачок перед инкубацией при 28 градусах Цельсия в вертикальном положении. Из логарифмической фазы культуры делают суспензию эпимастигота в ЛИТ-среде, дополненную генетином и сульфатом в конечной концентрации 200 000 клеток на миллилитр эпимастигота на миллилитр. После дозирования 100 микролитров суспензии на лунку 96 луночной пластины, внесите окончательный объем скважины 200 микролитров со средой.
Производят клеточную суспензию Vero в DMEM с добавлением 2% FCS в конечной концентрации 100 000 клеток на миллилитр. Посейте 100 микролитров суспензии на лунку в 96 луночных тканевых культуральных пластинах. Инкубируйте клетки на ночь для адгезии и на следующий день наблюдайте за клетками под микроскопом.
На следующий день промыть клеточный монослой Vero три раза 100 микролитрами стерильного PBS. Добавьте ранее полученные метациклические трипомастиготы. Добавьте кратность инфекции или MOI 10-1 на 100 микролитров DMEM, дополненных 2% FCS на лунку, и инкубируйте в течение шести часов, как показано ранее.
В конце инкубации дважды промыть пластину PBS и добавить 100 микролитров DMEM без фенольного красного с добавлением 2% FCS. После внесения суспензии клеток Vero в DMEM добавляют конечную концентрацию 1 миллион клеток на миллилитр. Посейте 800 000 клеток в пяти миллилитрах среды в колбах Т-25 и инкубируют в течение ночи для клеточной адгезии.
После того, как колба промыта PBS, добавьте трипомастиготы, добавьте MOI 10-1 в пяти миллилитрах DMEM, дополненных 2% FCS, и инкубируйте в течение ночи, как показано ранее. В конце инкубации дважды промыть колбу PBS. Добавьте пять миллилитров свежего DMEM с добавлением 2% FCS и инкубируйте в течение четырех дней.
В конце инкубации, после наблюдения за присутствием супернатанта на наличие трипомастиготов под оптическим микроскопом. Количественно оцените трипомастиготы с помощью камеры Нойбауэра. Соберите супернатант в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в 7 000 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в DMEM без фенольного красного, дополненного 2% FCS для получения концентрации 1 млн трипомастигот на миллилитр. Посейте 100 микролитров суспензии трипомастигота на лунку в 96 луночных пластинах. Добавьте раствор бензнидазола к эпимастиготам, клеткам Веро с амастиготами или трипомастиготам, как описано в тексте рукописи.
Затем инкубируют эпимастиготы, устанавливают 28 градусов Цельсия в течение 72 часов и трипомастиготы или инфицированные клетки Веро амастиготами в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Для цветометрического анализа установите пустые скважины, добавив 100 микролитров PBS или соответствующей среды. Далее добавляют 40 микролитров раствора подложки CPRG и 10 микролитров моющего раствора в каждую скважину для получения конечной концентрации 200 микромолярного CPRG и 0,1% моющего средства в конечном объеме 250 микролитров в каждой скважине.
После инкубации при 37 градусах Цельсия в течение двух часов измеряют поглощение на 595 нанометрах с помощью микропластинчатого спектрофотометра. В программном обеспечении создайте новый протокол, выбрав поглощение в качестве метода обнаружения и конечную точку в качестве типа чтения, затем нажмите кнопку «ОК». Затем добавьте шаг чтения.
Введите выбранную длину волны и нажмите кнопку «ОК». В разделе макета пластины отметьте скважины для чтения, нажмите ok и нажмите на прочитанную пластину, подождите, пока значения появятся на экране, и экспортируйте их в электронную таблицу для анализа результатов и расчета значений поглощения с использованием вычитания, как описано в рукописи. В программном обеспечении для статистического анализа построить график концентрации BZN по сравнению с поглощением на уровне 595 нанометров в таблице XY.
Преобразуйте концентрации BZN в логарифмические значения, щелкнув Анализ, выбрав параметр преобразования и нажав кнопку ОК. Для получения значений IC50 нажмите кнопку «Анализировать» и в списке анализа XY выберите «Соответствие кривой нелинейной регрессии», затем нажмите кнопку «ОК». Затем перейдите в окно параметров, на вкладке модели перейдите к группе ингибирования реакции на дозу встроенных уравнений, выберите ингибитор журнала против переменного наклона ответа для параметров, поскольку метод ответа дозы оставляет все остальные вкладки со значениями по умолчанию, а затем нажмите, хорошо.
Щелкните раздел результатов, чтобы найти значение IC50, SD и правильность подгонки. Щелкните раздел графика, чтобы найти график XY логарифмической концентрации лекарственного средства по сравнению со значениями абсорбции и убедиться, что кривая также отрисована другим цветом. В настоящем исследовании значение IC50, полученное для эпимастиготов, составляло приблизительно 20 микромоляров, аналогично предыдущим исследованиям.
Кроме того, результаты показали активность бета-галактозидазы эпимастиготов с течением времени. Очень важно выполнять хотя бы реплики каждого тестируемого условия и минимизировать ошибки в управлении томами.
