Очистка F1-ATPase основана на классических биохимических методах, которые оказались решающими для нашего понимания механизма производства АТФ другими синтазы АТФ. Основным преимуществом этого метода является то, что он производит очень чистый фермент, пригодный для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. Хотя этот протокол оптимизирован для изоляции F1-ATPase от трипаносом, он может быть адаптирован к другим источникам, таким как ткани или клетки культуры, а также к различным патогенным протеистам.
Этот метод может привести к выявлению новых препаратов для лечения тяжелых заболеваний человека. Например, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase является аутентифицированной целью препарата для лечения туберкулеза. Для начала протокола, оттепель и мягко resuspend митохондриальных пузырьков, также известный как митопласты, ранее изолированные гипотонического лиза от одного раза 10 до 11 до 2 раз 10 до 11 клеток проциклической трипаносомы бруци в пяти миллилитров ледяной Buffer A.Keep образца охлаждается.
Затем определите концентрацию белка в суспензии по бицинхониновой кислоте, или BCA, белковому анализу в соответствии с инструкциями производителя. Выполните серию разбавления BSA в ультра чистой воде, чтобы построить стандартную кривую. Разбавить небольшое количество образца от 20 до 100 раз с ультра чистой водой, чтобы вписаться в диапазон стандартов BSA.
После расчета общего количества белка в образце, довести концентрацию белка до 16 миллиграммов на миллилитр, разбавляя его с дополнительными Buffer A.Then фрагмент митопластов в перевернутые пузырьки и мембраны штук sonication семь раз в течение 15 секунд каждый, с общей энергией от 70 до 100 джоулей на импульс с микротипом диаметром 3,9 миллиметра. При фрагментации инкубировать образец на льду в течение 30 секунд между импульсами. После звукового действия подвеска может показаться немного темнее.
Отложения фрагментов мембраны путем ультрацентрифугации при 54 000 г в течение 16 часов или при 98 000 г в течение пяти часов при четырех градусах Цельсия. Декант супернатант и приступить к экстракции хлороформа. Рассчитайте объем буфера B на основе общего количества используемого буфера А.
Перенесите замороженный осадок из центрифуги в гомогенизатор. Переусейте гранулы митохондриальных мембран в буфере B с помощью небольшого гомогенизатора Dounce. Перенесите подвеску на 50 миллилитровую коническую трубку.
Удалите образец со льда, и сохранить образец и все решения при комнатной температуре для остальных шагов. Затем добавьте хлороформ, насыщенный двумя молярными трисами, скорректированными с HCl до pH 8.5, один к одному. Закройте крышку плотно, и встряхните образец энергично в течение ровно 20 секунд.
Сразу же центрифуга смеси при температуре 8 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее перенесите верхнюю, пасмурную фазу на 1,6 миллилитров микротрубки. Добавьте ингибиторы протеазы в образец, чтобы заменить ингибиторы, удаленные при лечении хлороформом.
Центрифуга образцов при температуре 13 000 г в течение 30 минут при комнатной температуре. После вращения перенесите супернатант на свежие микротрубки и повторите центрифугу, чтобы удалить оставшийся нерастворимый материал. Equilibrate пять миллилитров анионные обмена колонки прилагается к быстрой белковой жидкой хроматографии системы с 50 миллилитров буфера колонки с скоростью потока пять миллилитров в минуту до поглощения на 280 нанометров и проводимости стабилизировать.
Загрузите супернатант на уравновешенную колонку со скоростью потока в миллилитр в минуту. Подождите, пока поглощение на 280 нанометров стабилизируется на заднем плане. Нанесите 25 миллилитров линейного градиента буфера elution столбца от 0%до 100% при скорости потока 0,5 миллилитров в минуту и соберите одну миллилитровую фракцию.
Анализ 10 микролитров каждой отдельной фракции, соответствующей основному пику элюции для гидролитической активности АТФ на миллилитр реакционной смеси анализом Pullman ATPase при рН 8.0. Бассейн фракций, которые демонстрируют активность ATPase. Сосредоточьте объединили образец мембранной ультрафильтрации с помощью спиновой колонки со 100 000 молекулярных фильтров PES для отсечения веса до 200-500 микролитров.
Затем приступайте к хроматографии исключения размера. Equilibrate Superose 6 Увеличение колонки прилагается к жидкой хроматографии системы, по крайней мере 48 миллилитров буфера SEC со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту. Нанесите образец на столбец.
Выполните хроматографию со скоростью потока 0,25 миллилитров в минуту, собирая при этом 0,25 миллилитровых фракций. Далее запустите 10 микролитров фракций, которые соответствуют пикам УФ-280 нанометрового следа абсорбционности на SDS-PAGE. Затем испачкаем образцы Кумасси Блю.
Проанализировать фракции, соответствующие первому крупному пику, содержащем пик F1 для гидролитической активности АТФ и чувствительность азида по анализу Pullman ATPase. Затем выполните анализ BCA, чтобы определить концентрацию белка. Наконец, держите очищенный F1-ATPase при комнатной температуре и используйте его в течение трех дней после очистки для применения ниже по течению.
Этот elution профиль хроматографии обмена аниона отображает абсорбцию УФ на 280 нанометров и концентрацию хлорида натрия в буфере элюции. Выбранные фракции были разделены на гель SDS-PAGE и окрашены красителем Coomassie Blue. Фракции, которые соответствуют основному пику элюции от хроматографии анионные обмены и содержат F1-ATPase, были объединились, сконцентрированы и использованы в качестве ввода для хроматографии исключения размера.
Основным загрязнителем является дигидролипойл дегидрогеназа, которая высовывается из столбца хроматографии с исключением размеров в качестве дискретного пика. F1-ATPase elutes в первом доминирующем, в основном симметричном пике. Coomassie Blue окрашивание типичного шаблона полосы после разделения очищенных F1-ATPase через SDS-PAGE показывает спорадические слабые полосы, видимые над бета-подразделением, которые представляют собой подкомплексы альфа-три бета три головных убора, димеры и олигомеры альфа- и бета-подразделений, и лишены каких-либо загрязняющих веществ, обнаруживаемых масс-спектрометрией.
Выполняя экстракции хлороформа, критический шаг протокола, важно встряхнуть образец энергично и перейти к центробежной разделения органических и aqueous фаз немедленно. После этой процедуры изолированный F1-ATPase можно подробно охарактеризовать масс-спектрометрией. Кроме того, он может быть использован в анализах активности или для структурных исследований, как самостоятельно, так и в присутствии различных ингибиторов или субстратных аналогов.
