Анализ ACT1-CUP1 может определить, влияет ли мутация на сплайсинг РНК до мессенджера, и дать представление о том, какой этап сплайсинга наиболее подвержен влиянию. Анализ ACT1-CUP1 связывает мутацию фактора сплайсинга с его влиянием на сложный процесс сплайсинга. Он использует простое считывание фенотипа роста и имеет широкий диапазон чувствительности.
Эффективное использование времени важно при проведении анализа ACT1-CUP1. Начните с анализа от пяти до 10 штаммов, чтобы свести к минимуму вызванные стрессом аберрации роста. Демонстрировать этот процесс будут я и Изабель Марасиган, исследователь из моей лаборатории.
Для начала добавьте 790 миллиграммов агара и перемешивание в каждую бутылку. В большом стакане подготовьте среду для роста выпадения лейцина для всех медных пластин, которые будут залиты. Это включает в себя 265 миллиграммов азотистой основы дрожжей, 64 миллиграмма капельной смеси, минус лейцин и 34 миллилитра деионизированной воды на каждую наливаемую тарелку.
Затем добавьте 34 миллилитра раствора выпадающей среды лейцина в каждый подготовленный 100-миллилитровый флакон и крышку алюминиевой фольгой. Далее автоклав стерилизуют и растворяют агар, используя рекомендуемый для автоклава жидкостный цикл. Как можно быстрее после автоклавирования добавляйте в каждый флакон по четыре миллилитра 20% глюкозы.
Затем сопоставьте этикетку тюбика с этикеткой бутылки, чтобы добавить два миллилитра разведения сульфата меди каждый в его предполагаемую бутылку. Используя перемешиваемую пластину, перемешайте в течение примерно 30 секунд и налейте или пипетку 35 миллилитров в маркированную пластину, избегая пузырьков. На штамм дрожжей добавьте девять миллилитров среды роста лейкина и один миллилитр 20% глюкозы в стерильную коническую трубку с 50 миллилитрами.
Используя стерильную палочку или наконечник пипетки, соберите небольшой образец дрожжей и привите среду. Затем встряхните все ночные культуры при 180 оборотах в минуту и 30 градусах Цельсия. Затем добавьте 100 микролитров культуры в кювету, содержащую 900 микролитров воды на штамм.
После этого измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра и рассчитайте разбавление, необходимое для оптической плотности 0,5 в конечном объеме в два миллилитра. Затем разбавьте каждый штамм до оптической плотности 0,5 в 10% глицерине и повторно измерьте оптическую плотность, чтобы подтвердить, что плотность клеток находится в желаемом диапазоне. После установки стерильного рабочего места зажгите горелку Бунзена.
Для 48-контактного репликатора пипетку 200 микролитров каждого разбавленного штамма в отдельный колодец из 96-луночной пластины и заполните пустые пространства в сетке шесть на восемь 200 микролитрами 10% глицерина. Затем окуните репликатор в неглубокую посуду с 95% этанолом и пламени для стерилизации. Дайте ему остыть в течение как минимум двух минут после того, как пламя погаснет, чтобы избежать теплового удара по клеткам.
Поместите четыре пластины рядом с горелкой и снимите крышки. Опустите репликатор в пластину с 96 лунками и поднимите ее одним быстрым движением. Затем аккуратно положите на тарелку и слегка покачивайтесь взад и вперед, чтобы облегчить хорошую передачу.
Поднимите вверх одним быстрым движением и поместите в точно такую же ориентацию в 96-луночную плиту. После того, как пластина была покрыта, двигайтесь плавным движением в сторону, но все еще внутри стерилизующего зонтика пламени. Дайте пластинам полностью высохнуть, прежде чем надеть крышки, обычно три-пять минут.
Затем высиживают пластины в течение трех дней при 30 градусах Цельсия. После снятия пластин с инкубатора визуально осмотрите их. Анализ роста показал, что по мере увеличения концентрации меди штаммы с более низким сращиванием показывают снижение слияния до такой степени, что концентрация меди становится смертельной.
Дрожжевой фон включает в себя нарушенный ген ADE2, в результате чего колонии имеют различные оттенки красного. А зрелые колонии были темно-красного цвета. Во время обшивки, если репликатор поднят вверх при движении влево или вправо, привести под углом или встряхнуть над пластиной, можно создать колонии овальной формы, или микроколонии из мелких капель клеточного раствора.
Дрожжи с репортером A3c сохранились до 0,15 миллимолярной меди, в то время как репортерные клетки дикого типа сохраняли жизнеспособность до конца диапазона протестированных концентраций меди. Результаты анализа показали, что различные основания в позиции 57 snRNA U6 оказывают уникальное воздействие на сплайсеосому в сочетании с мутацией 5 простых или ветвистых участков. В то время как U57c является аддитивной мутацией, снижающей толерантность к меди, в сочетании с A3c и филиалом сайта G репортеров.
Напротив, U57a увеличивает толерантность к меди, поскольку способствует переходу ко второму этапу. После того, как возмущение сплайсинга идентифицировано с помощью ACT1-CUP1, исследования могут перейти к более количественным методам, таким как расширение праймера и идентификация нарушенного молекулярного взаимодействия с помощью EMSA и ферментативного зондирования. ACT1-CUP1 был основополагающим анализом, формирующим наше понимание надежности и селективности дрожжевой сплайсеосомы.
И это продолжает расширять наше понимание сплайсеосомальной функции.
