Этот протокол описывает клеточный анализ для мониторинга эффективности сплайсинга с использованием адаптируемого управляющего репортера. Этот репортерский анализ может быть использован для изучения эффектов связанных с заболеванием мутаций в Exxon или сайтах сращивания, а также для разработки терапии, в частности одной частицы, для улучшения распознавания мутантных до пятиточечных сайтов сращивания. Прохождение в клетках Hela аспирирует отработанную среду и инкубирует клетки тремя миллилитрами 0,2 5% трипсов, содержащими один миллимоляр ЭДТА, при 37 градусах Цельсия в течение трех минут.
После инкубации на семь миллилитров свежего ДМЭМ и переносят клеточную суспензию в 10-миллилитровую трубку. Центрифугирование клеток. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах свежего DMEM и нанесите клетки на новую чашку для культуры тканей при 20% слиянии для преходящих трансфекции.
Подсчитайте хела-клетки с помощью чистого гемоцитометрического слайда и подготовьте суспензию плотностью от 2,5 раз 10 до пятой клетки на миллилитр, посейте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку из 12 лунок и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. На следующий день аспирируйте отработанную среду и добавьте в тарелку 800 микролитров свежего ДМЭМ с сывороткой. Подготовьте трансфекционные смеси и вихрьте их в течение 15 секунд.
Затем центрифугируют смеси и инкубируют их при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации добавляют все 200 микролитров трансфекционной смеси в одну лунку из 12 лунок хела-клеточной пластины для достижения конечного объема в один миллилитр на лунку, и инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов. Подготовленные реакции маркировки являются инкубационными.
Повторное суспендирование 25-килограммовых шариков молекулярной массы Дальтона путем мягкого вихря в течение 10 секунд. Затем переложите 600 микролитров повторно суспендированных бусин в одноразовую мини-колонку, помещенную в 1,5-миллилитровую коллекционную трубку, и верните запас бисера до четырех градусов Цельсия. Центрифугируйте колонны и отбросьте поток через них.
Затем дважды промыть бусины, добавив в столб 300 микролитров воды без РНК. После второй промывки переложите мини-колонку в новую 1,5-миллилитрную центрифужную трубку и добавьте в колонну реакционную смесь киназы. Центрифугируйте колонну и соберите поток, содержащий меченые P32 олигонуклеотиды.
Добавьте два микрограмма РНК, извлеченных из спиральных клеток, в 200 микролитровые микроцентрифужные трубки и добавьте воду без РНК, чтобы составить объем до 6,55 микролитров. Затем добавьте 0,9 микролитра мастер-микс по одному в каждую ПЦР-трубку, содержащую образцы РНК, и инкубируйте трубки сначала при 65 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем на льду в течение одной минуты. Далее при 2,55 микролитрах мастер-микс два, с каждой трубкой, содержащей РНК, и мастер-микс один, и инкубируют трубки при комнатной температуре в течение 10 минут.
После инкубации переложите трубки в термоциклер и инкубируйте сначала при 50 градусах Цельсия в течение 60 минут, а затем при 70 градусах Цельсия, в течение 15 минут. После инкубации добавьте в каждый образец 10 микролитров 2X формамидного РНК-нагрузочного красителя и приступайте к разделению фрагментов по странице МАУ. Синтез ДНК Перси.
Добавьте два микрограмма РНК, извлеченных из трансективированных клеток хела, в 200 микролитровые микроцентрифужные трубки и добавьте РНК свободной воды, чтобы составить объем до низких 11 микролитров. Затем добавьте два микролитра, мастер-микс по одному к каждому образцу и высиживайте сначала при 65 градусах Цельсия в течение пяти минут, затем на льду в течение одной минуты. Далее добавляют семь микролитров, мастер-микс по два в каждую трубку и инкубируют трубки при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего инкубируют при 50 градусах Цельсия в течение 60 минут и 70 градусах Цельсия в течение 15 минут.
Затем для ПЦР разводят реакцию С ДНК, чтобы получить концентрацию 100 нанограмм на микролитр, и переносят один микролитр каждого образца CDNA в новые пробирки ПЦР. Добавьте 10,5 микролитров мастер-микса в каждую трубку, содержащую CDNA, и выполните ПЦР. Использование термоциклера после завершения ПЦР.
Добавьте 12,5 микролитров 2X формамидного ДНК-нагрузочного красителя в каждую трубку. Нагрейте образцы при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут и приступайте к выполнению страницы МАУ. Пипетка пять микролитров разбавленной CDNA в отдельные скважины из 96-луночной пластины qpcr трипликат.
Затем добавьте 10 микролитров ПЦР-смеси в реальном времени в каждую скважину, запечатайте пластины оптической пленкой и центрифугой для сбора реакций на дно скважины, затем выполните qpcr при сборе пороговых значений цикла количественного определения целевого ампликона. Перед загрузкой маркеров и образцов промывайте скважины буфером TBE, чтобы удалить осевший мочевину. Затем загрузите 10 микролитров каждого образца на скважину и запустите гель при 300-500 вольтах в течение двух-трех часов или до тех пор, пока ксилол не достигнет дна.
После электрофореза снимите стеклянные пластины с аппарата электрофореза и аккуратно разделите две пластины так, чтобы гель лежал ровно на любой стеклянной поверхности, затем переложите гель на фильтровальную бумагу и накройте его полиэтиленовой пленкой, используя гелевую сушилку вакуумом, высушите гель при 80 градусах Цельсия в течение 30 минут; затем поместите высушенный гель в люминофорную кассету для ночной инкубации при комнатной температуре. При экспрессии в клетках хела режущий репортер dup 51 minnijean экспрессирует зрелый полноразмерный транскрипт, в котором Exxon two эффективно сращивается. Пять первичных мутаций сайта сращивания и dup 51 P уменьшают включение Exxon two с 95 до 30%, что приводит к образованию более короткого транскрипта.
Совместная экспрессия dup 51 P с U15A SNRNA спасает Exxon от двух сращиваний и восстанавливает формирование полноразмерного транскрипта. Напротив, совместное выражение с диким типом U1 или вариантом U15G не оказывает аналогичного влияния на сплайсинг dup 51P. При обнаружении вариантов транскриптов U15A, по первичному расширению, используется U1 от семи до 26 олигонуклеотида, который имеет длину 20 нуклеотидов и пары оснований вблизи аденина в пятой позиции U1 SNRNA.
В присутствии только DATP U1 от семи до 26 позволяет включать от двух до трех нуклеотидов для эндогенной дикой SNRNA типа U1, дающей длинный продукт с 22 или 23 нуклеотидами. Для вариантов U15A и U15G расширение прекращается после добавления одного аденозина, образующего 21 нуклеотидный продукт. После нормализации экспрессии U2 SNRNA трансфектированные варианты U1 дикого типа U1 5g и U15A экспрессировались в три-пять раз по сравнению с эндогенной SNRNA.
Качество извлеченной РНК имеет решающее значение для анализа сплайсинга. Поэтому настоятельно рекомендуется использование воды, свободной от РНК, и обеззараживание услуг инактивантами РНК. Описанная здесь система отчетов может быть применена для изучения роли РНК U1 SN в правилах сплайсинга для обращения вспять эффекта мутаций сплайсинга флэш-цен для глушения генов с использованием модифицированных U1SN РНК.
