ACT1-CUP1 분석은 돌연변이가 전령 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는지 확인하고 어떤 스플라이싱 단계가 가장 큰 영향을 받는지 나타낼 수 있습니다. ACT1-CUP1 분석은 접합 인자 돌연변이를 복잡한 접합 과정에 미치는 영향과 연결합니다. 성장 표현형의 간단한 판독을 활용하며 넓은 감도 범위를 가지고 있습니다.
ACT1-CUP1 분석을 수행할 때는 시간을 효율적으로 사용하는 것이 중요합니다. 스트레스로 인한 성장 이상을 최소화하기 위해 5-10 개의 균주에 대한 분석으로 시작하십시오. 이 과정을 시연하는 것은 저와 제 실험실의 학부 연구원 인 Isabelle Marasigan이 될 것입니다.
시작하려면 각 병에 790mg의 한천과 교반 막대를 추가하십시오. 큰 비커에서 부을 모든 동판에 대한 류신 드롭아웃 성장 배지를 준비합니다. 여기에는 효모 질소 염기 265mg, 드롭아웃 믹스 64mg, 류신 제외 및 부을 각 플레이트에 대한 탈이온수 34밀리리터가 포함됩니다.
저어 녹인 다음, 준비된 각 100 밀리리터 병에 류신 드롭아웃 성장 배지 용액 34 밀리리터를 첨가하고, 알루미늄 호일로 캡을 씌운다. 다음으로, 오토 클레이브에 권장되는 액체 사이클을 사용하여 한천을 살균하고 용해시키는 오토 클레이브. 오토 클레이브 후 가능한 한 빨리 각 병에 20 % 포도당 4 밀리리터를 첨가하십시오.
그런 다음 튜브 라벨을 병 라벨과 일치시켜 각각 2밀리리터의 황산구리 희석액을 의도한 병에 추가합니다. 교반 플레이트를 사용하여 약 30초 동안 혼합하고 거품을 피하면서 라벨이 부착된 플레이트에 35ml를 붓거나 피펫팅합니다. 효모 균주 당 9 밀리리터의 류신 드롭 아웃 성장 배지와 1 밀리리터의 20 % 포도당을 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가하십시오.
멸균 스틱 또는 피펫 팁을 사용하여 효모의 작은 견본을 수집하고 배지를 접종합니다. 그런 다음 밤새 배양된 모든 배양물을 180RPM 및 섭씨 30도에서 흔듭니다. 다음으로, 균주 당 900 마이크로 리터의 물을 포함하는 큐벳에 100 마이크로 리터의 배양 물을 첨가하십시오.
그 후, 분광 광도계로 광학 밀도를 측정하고 2 밀리리터의 최종 부피에서 0.5의 광학 밀도에 필요한 희석을 계산하십시오. 그 후, 각 균주를 10%글리세롤에서 광학밀도 0.5로 희석하고 광학밀도를 재측정하여 세포 밀도가 원하는 범위 내에 있는지 확인하였다. 멸균 작업 장소를 설정 한 후 분젠 버너에 불을 붙입니다.
48핀 복제기의 경우, 희석된 각 균주 200마이크로리터를 96웰 플레이트의 별도의 웰에 피펫팅하고 6x8 그리드의 빈 공간을 200마이크로리터의 10% 글리세롤로 채웁니다. 그런 다음 복제기를 95 % 에탄올과 화염의 얕은 접시에 담그고 살균합니다. 세포에 충격을 가하는 열을 피하기 위해 화염이 꺼진 후 최소 2분 동안 식히십시오.
버너 근처에 4 개의 판을 놓고 뚜껑을 제거하십시오. 복제기를 96웰 플레이트에 담그고 한 번의 빠른 동작으로 들어 올립니다. 그런 다음 접시에 부드럽게 놓고 좋은 이동을 용이하게하기 위해 앞뒤로 가볍게 흔 듭니다.
한 번의 빠른 동작으로 들어 올려 96웰 플레이트에 정확히 같은 방향으로 놓습니다. 플레이트를 도금 한 후 측면으로 부드럽게 움직이되 여전히 화염의 살균 우산 내에서 움직입니다. 뚜껑을 덮기 전에 접시를 완전히 말리십시오(보통 3-5분).
그런 다음 플레이트를 섭씨 30도에서 3 일 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 육안으로 검사하십시오. 성장 분석은 구리 농도가 증가함에 따라 접합이 낮은 균주가 구리 농도가 치명적일 정도로 컨플루언스가 감소한다는 것을 보여주었습니다.
효모 배경에는 파괴된 ADE2 유전자가 포함되어 있어 콜로니가 다양한 빨간색 음영을 띠게 됩니다. 그리고 성숙한 식민지는 짙은 붉은 색이었습니다. 플레이팅하는 동안 복제기를 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하면서 들어 올리거나 비스듬히 가져 오거나 플레이트 위에서 흔들면 타원형의 콜로니 또는 작은 세포 용액 방울로부터 마이크로 콜로니를 만들 수 있습니다.
A3c 리포터를 사용한 효모는 0.15 밀리몰 구리까지 생존한 반면, 야생형 리포터 세포는 시험된 구리 농도 범위의 끝까지 생존력을 유지하였다. 분석 결과는 U6 snRNA 위치 57의 상이한 염기가 5 프라임 또는 분지 부위 돌연변이와 결합하여 스플라이세오솜에 독특한 영향을 미친다는 것을 보여주었다. U57c는 A3c 및 분기 사이트 G 리포터와 함께 구리 내성을 감소시키는 부가 돌연변이입니다.
대조적으로, U57a는 두 번째 단계로의 진행을 촉진하기 때문에 구리 내성을 증가시킵니다. ACT1-CUP1을 통해 스플라이싱 섭동이 확인된 후 연구는 프라이머 확장 및 EMSA 및 효소 프로빙을 통한 중단된 분자 상호 작용 식별과 같은 보다 정량적인 방법으로 이동할 수 있습니다. ACT1-CUP1은 효모 스플라이세오솜의 견고성과 선택성에 대한 이해를 구축하는 기초 분석법이었습니다.
그리고 그것은 spliceosomal 기능에 대한 우리의 이해를 계속 확장합니다.
