Der ACT1-CUP1-Assay kann feststellen, ob eine Mutation das Pre-Messenger-RNA-Spleißen beeinflusst, und einen Hinweis darauf geben, welcher Spleißschritt am stärksten betroffen ist. Der ACT1-CUP1 Assay verbindet die Spleißfaktormutation mit ihrem Einfluss auf den komplexen Prozess des Spleißens. Es nutzt das einfache Auslesen des Wachstumsphänotyps und hat einen breiten Empfindlichkeitsbereich.

Bei der Durchführung eines ACT1-CUP1-Assays ist eine effiziente Zeitnutzung wichtig. Beginnen Sie mit einem Assay von fünf bis 10 Stämmen, um stressbedingte Wachstumsanomalien zu minimieren. Ich und Isabelle Marasigan, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren den Prozess.

Fügen Sie zunächst 790 Milligramm Agar und einen Rührriegel zu jeder Flasche hinzu. Bereiten Sie in einem großen Becherglas das Leucin-Dropout-Wachstumsmedium für alle zu gießenden Kupferplatten vor. Dazu gehören 265 Milligramm Hefestickstoffbasis, 64 Milligramm Dropout-Mischung minus Leucin und 34 Milliliter entionisiertes Wasser für jede zu gießende Platte.

Zum Auflösen umrühren Geben Sie dann 34 Milliliter der Leucin-Dropout-Wachstumsmedienlösung zu jeder vorbereiteten 100-Milliliter-Flasche hinzu und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie. Als nächstes Autoklaven, um den Agar zu sterilisieren und aufzulösen, unter Verwendung des empfohlenen Flüssigkeitszyklus für den Autoklaven. Fügen Sie so schnell wie möglich nach dem Autoklavieren vier Milliliter 20% Glukose zu jeder Flasche hinzu.

Passen Sie dann das Tubenetikett an das Flaschenetikett an, um die jeweils zwei Milliliter Kupfersulfatverdünnungen in die beabsichtigte Flasche zu geben. Verwenden Sie eine Rührplatte, mischen Sie für ca. 30 Sekunden und gießen oder pipettieren Sie 35 Milliliter in die beschriftete Platte, um Blasen zu vermeiden. Fügen Sie pro Hefestamm neun Milliliter Leucin-Dropout-Wachstumsmedien und einen Milliliter 20% Glukose in ein steriles, 50-Milliliter-konisches Röhrchen hinzu.

Sammeln Sie mit einem sterilen Stab oder einer Pipettenspitze ein kleines Stück Hefe und impfen Sie die Medien. Dann schütteln Sie alle Nachtkulturen bei 180 U / min und 30 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Kultur zu einer Küvette hinzu, die 900 Mikroliter Wasser pro Stamm enthält.

Anschließend messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer und berechnen die erforderliche Verdünnung bei einer optischen Dichte von 0,5 in einem Endvolumen von zwei Millilitern. Verdünnen Sie dann jeden Stamm auf die optische Dichte 0,5 in 10% Glycerin und messen Sie die optische Dichte erneut, um zu bestätigen, dass die Zelldichte im gewünschten Bereich liegt. Nachdem Sie einen sterilen Arbeitsort eingerichtet haben, zünden Sie einen Bunsenbrenner an.

Für einen 48-poligen Replikator pipetten Sie 200 Mikroliter jedes verdünnten Stammes in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte und füllen die leeren Räume im Sechs-mal-Acht-Raster mit 200 Mikrolitern 10% Glycerin. Dann tauchen Sie den Replikator in eine flache Schale mit 95% Ethanol und flammen Sie zur Sterilisation. Lassen Sie es mindestens zwei Minuten abkühlen, nachdem die Flamme erloschen ist, um einen Hitzeschock für die Zellen zu vermeiden.

Stellen Sie vier Teller in die Nähe des Brenners und entfernen Sie die Deckel. Tauchen Sie den Replikator in die 96-Well-Platte und heben Sie ihn in einer schnellen Bewegung an. Dann vorsichtig auf den Teller legen und leicht hin und her schaukeln, um einen guten Transfer zu erleichtern.

Mit einer schnellen Bewegung anheben und in genau der gleichen Ausrichtung in die 96-Well-Platte legen. Nachdem eine Platte plattiert wurde, bewegen Sie sich mit einer sanften Bewegung zur Seite, aber immer noch innerhalb des Sterilisationsschirms der Flamme. Lassen Sie die Teller vollständig trocknen, bevor Sie die Deckel aufsetzen, normalerweise drei bis fünf Minuten.

Dann inkubieren Sie die Platten für drei Tage bei 30 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platten aus dem Inkubator genommen haben, überprüfen Sie sie visuell. Der Wachstumstest zeigte, dass mit steigender Kupferkonzentration Stämme mit geringerem Spleißen eine verminderte Konfluenz zeigen, bis zu dem Punkt, an dem die Kupferkonzentration tödlich wird.

Der Hefehintergrund enthält ein gestörtes ADE2-Gen, was dazu führt, dass die Kolonien unterschiedliche Rottöne haben. Und die reifen Kolonien waren tiefrot gefärbt. Wenn der Replikator während der Beschichtung angehoben wird, während er sich nach links oder rechts bewegt, schräg gebracht wird oder wenn er über der Platte geschüttelt wird, ist es möglich, ovale Kolonien oder Mikrokolonien aus kleinen Tröpfchen der Zelllösung zu erzeugen.

Hefe mit dem A3c-Reporter überlebte bis 0,15 Millimolar Kupfer, während die Wildtyp-Reporterzellen bis zum Ende des getesteten Kupferkonzentrationsbereichs lebensfähig blieben. Die Assay-Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Basen an der U6-snRNA-Position 57 einzigartige Auswirkungen auf das Spleißosom in Kombination mit einer 5-Prime- oder Zweigstellenmutation haben. Während U57c eine additive Mutation ist, die die Kupfertoleranz verringert, in Kombination mit A3c- und Zweigstellen-G-Reportern.

Im Gegensatz dazu erhöht U57a die Kupfertoleranz, da es die Progression zur zweiten Stufe fördert. Nachdem die Spleißstörung durch ACT1-CUP1 identifiziert wurde, kann die Forschung zu quantitativeren Methoden übergehen, wie der Primerverlängerung und der Identifizierung gestörter molekularer Wechselwirkungen durch EMSAs und enzymatische Sondierung. ACT1-CUP1 war ein grundlegender Assay, der unser Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißsoms vertiefte.

Und es erweitert weiterhin unser Verständnis der spleißeosomalen Funktion.