ACT1-CUP1アッセイは、変異がプレメッセンジャーRNAスプライシングに影響を与えるかどうかを識別し、どのスプライシングステップが最も影響を受けるかを示すことができます。ACT1-CUP1アッセイは、スプライシング因子の変異をスプライシングの複雑なプロセスへの影響に関連付けます。成長表現型の単純な読み出しを利用し、広い感度範囲を有する。
ACT1-CUP1アッセイを実施する際には、時間の効率的な使用が重要です。ストレスによる成長異常を最小限に抑えるために、5〜10株のアッセイから始めます。このプロセスを実演するのは、私と私の研究室の学部生研究者であるイザベル・マラシガンです。
はじめに、各ボトルに790ミリグラムの寒天と攪拌子を加えます。大きなビーカーで、注ぐすべての銅板用のロイシンドロップアウト成長培地を準備します。これには、注ぐ各プレートに265ミリグラムの酵母窒素ベース、64ミリグラムのドロップアウトミックス、ロイシンを差し引いたもの、および34ミリリットルの脱イオン水が含まれます。
攪拌して溶解し、次に、34ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地溶液を各調製した100ミリリットルのボトルに加え、アルミホイルでキャップする。次に、オートクレーブを滅菌し、寒天を溶解し、オートクレーブに推奨される液体サイクルを使用する。オートクレーブ後できるだけ早く、各ボトルに4ミリリットルの20%グルコースを加えます。
次に、チューブラベルをボトルラベルに合わせ、2ミリリットルの硫酸銅希釈液をそれぞれ目的のボトルに追加します。攪拌プレートを使用して、約30秒間混合し、気泡を避けて、ラベル付けされたプレートに35ミリリットルを注ぐかピペットで入れます。酵母株あたり、9ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地と1ミリリットルの20%グルコースを滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に加えます。
滅菌スティックまたはピペットチップを使用して、酵母の小さな見本を集め、培地に接種します。次に、すべての一晩培養物を180 RPMと摂氏30度で振ってください。次に、1株あたり900マイクロリットルの水を含む100マイクロリットルの培養物をキュベットに加えます。
その後、分光光度計で光学密度を測定し、最終容量2ミリリットルで光学密度0.5になるために必要な希釈率を計算します。その後、各菌株を10%グリセロールで光学濃度0.5に希釈し、光学濃度を再測定して、細胞密度が所望の範囲内にあることを確認する。無菌の作業場所を設定した後、ブンゼンバーナーに火をつけます。
48ピンレプリケーターの場合、希釈した各株200マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルにピペットで入れ、6×8グリッドの空きスペースに200マイクロリットルの10%グリセロールを入れます。次に、レプリケーターを95%エタノールと炎の浅い皿に浸して滅菌します。細胞に熱衝撃を与えないように、炎が消えた後、少なくとも2分間冷まします。
バーナーの近くに4枚のプレートを置き、蓋を外します。リプリケーターを96ウェルプレートに浸し、1回の素早い動きで持ち上げます。次に、プレートにそっと置き、前後に軽く揺り動かして、うまく移動できるようにします。
1回の素早い動きで持ち上げ、96ウェルプレート内でまったく同じ向きに置きます。プレートがメッキされた後、滑らかな動きで横に移動しますが、それでも炎の滅菌傘内にあります。蓋をする前に、プレートを完全に乾かしてください(通常は3〜5分)。
次に、プレートを摂氏30度で3日間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出した後、それらを目視検査する。成長アッセイは、銅濃度が増加するにつれて、スプライシングの低い株がコンフルエント性を低下させ、銅濃度が致命的になることを示しました。
酵母の背景には破壊されたADE2遺伝子が含まれており、その結果、コロニーはさまざまな赤の色合いになります。そして成熟したコロニーは濃い赤でした。プレーティング中に、レプリケーターを左右に動かしながら持ち上げたり、斜めに持ってきたり、プレート上で振ったりすれば、細胞溶液の小さな液滴から楕円形のコロニーやマイクロコロニーを作ることができる。
A3cレポーターを含む酵母は0.15ミリモルの銅まで生存しましたが、野生型レポーター細胞はテストされた銅濃度の範囲の終わりまで生存率を維持しました。アッセイ結果は、U6 snRNA位置57の異なる塩基が、5プライムまたは分岐部位変異と組み合わせてスプライソソームに独特の影響を与えることを示しました。U57cは加加突然変異ですが、A3cおよびブランチサイトGレポーターと組み合わせて銅耐性を低下させます。
対照的に、U57aは第2段階への進行を促進するため、銅耐性を高めます。ACT1-CUP1によってスプライシング摂動が同定された後、研究はプライマー伸長やEMSAや酵素プロービングによる破壊された分子相互作用の同定など、より定量的な方法に移行できます。ACT1-CUP1は、酵母スプライソソームの堅牢性と選択性に関する理解を深めるための基礎となるアッセイです。
そして、それはスプライソソーム機能の理解を拡大し続けています。
