Эта методология важна тем, что она позволяет воспроизводимый и точный метод количественной оценки местно применяемых лекарственных средств с использованием когерентной рамановской визуализации. Другие методологии предоставляют громоздкую кожную фармакокинетическую информацию, в то время как эта методология может предоставлять как объемную, так и микромасштабную кожную фармакокинетическую информацию, такую как путь проникновения лекарственного средства. Визуализация, количественная оценка и пути проникновения позволят разрабатывать лекарственные препараты с учетом конкретного пути для достижения целевого участка.
Подготовка тканей окажется самой сложной частью этой методологии. Ткань должна быть достаточно тонкой, чтобы можно было читать сквозь кожу. Чтобы начать подготовку обнаженной мыши кожной ткани уха, приобретите усыпленных обнаженных мышей и удалите уши мыши с помощью щипцов и микрохирургических ножниц.
Затем поместите одно ухо в большую чашку Петри размером 60 миллиметров на 15 миллиметров. Затем дважды промойте ухо мыши PBS и каждый раз вытирайте ухо насухо с помощью стеклоочистителя. При использовании в течение 24 часов поместите ухо в PBS в небольшую чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров при температуре от двух до восьми градусов цельсия.
Для использования после 24 часов сбора урожая поместите колос в чашку Петри без PBS, затем накройте блюдо парапленкой для хранения в морозильной камере при минус 20 градусах Цельсия. Во время работы под биологическим капотом поместите ткань кожи человека в большую чашку Петри стороной рогового слоя лицом вниз, чтобы подкожный жир был доступен. Затем используйте щипцы и микрохирургические ножницы для удаления подкожного жира.
После того, как подкожный жир больше не может быть удален ножницами, используйте одноразовый скальпель с 10 лезвиями под углом 45 градусов к коже, чтобы удалить оставшийся подкожный жир, удерживая кожу неподвижно щипцами. Когда жир удаляется, разделите кожу человека на один сантиметр на один сантиметр кусочков. Для липидной визуализации поместите переднюю часть уха мыши лицом к стеклянному дну 35-миллиметровой тарелки с нулевым числом.
Для кожи человека поместите кожу с роговым слоем, обращенным вниз, чтобы обеспечить количественную оценку препарата от поверхностных до более глубоких слоев. После того, как ткань была центрирована на стеклянном дне, используйте аппликатор хлопкового наконечника, чтобы убедиться, что кожа плоская и имеет полный контакт с поверхностью крышки стеклянной нижней тарелки. Чтобы предотвратить любое движение во время визуализации, поместите шайбу поверх кожи и убедитесь, что ткань видна через центральное отверстие шайбы для обнаружения стимулированного комбинационного рассеяния или передачи SRS.
Нанесите заранее определенную дозу препарата на кожу, затем используйте палец в перчатке, чтобы потереть препарат по часовой стрелке в течение 30 секунд. По истечении времени, отведенного для проникновения состава, удалите излишки состава, прежде чем помещать кожу со стороны состава лицом к стеклянной нижней посуде. Затем перейдите к экспериментальной установке, включив программное обеспечение Microscope Control или MC.
Глядя через окуляр, отрегулируйте осевой фокус с помощью регуляторной ручки, чтобы убедиться, что ткань находится в фокусе. По завершении разблокируйте насос и балки Стокса и убедитесь, что каналы ALG1 и ALG2 включены. Убедитесь, что фотодиод SRS находится над конденсатором, затем нажмите Focus x2 на программном обеспечении MC, чтобы визуализировать кожу в каналах CARS и SRS.
В модуле Multi-Area Time Lapse или MATL перейдите на вкладку Вид и щелкните Список зарегистрированных точек, чтобы появился список изображений. Как только роговой слой идентифицирован, прокрутите осевой фокус или Z-фокус, чтобы определить конкретные стратификации ткани. Определенные глубины могут быть добавлены в кожу, такие как роговой слой, сальные железы, адипоциты или подкожный жир, как определено во время живой визуализации с липидным контрастом.
Однако, если необходимо взять целые стеки глубины, позиции XY могут быть добавлены, а относительная Z-позиция может быть проигнорирована. В случае визуализации определенной глубины для каждой стратификации кожи выберите точку регистрации, чтобы добавить ее в очередь MATL. Для стеков полной глубины щелкните Зарегистрировать точку для каждой позиции XY с выделением глубины в окне Параметры сбора.
Затем установите количество повторов равным одному в модуле MATL и нажмите кнопку Готово. Когда стрелка Воспроизведения изменится с серого на черный, нажмите кнопку Воспроизвести, чтобы начать визуализацию предварительного стека липидов. Как только цикл визуализации будет завершен, заблокируйте как накачку, так и лучи Стокса и измените длину волны на графическом интерфейсе лазерного пользователя на желаемую длину волны на основе целевого числа волны или комбинационной вибрации.
Отрегулируйте ручную стадию задержки времени, гарантируя, что те же силы используются для изображения липидного и активного фармацевтического ингредиента или API, которые установлены априори. После того, как общее количество повторов цикла было выбрано, разблокируйте пучок насоса и проверьте, соответствует ли мощность желаемой мощности с помощью фотодиода, прежде чем нажать кнопку Воспроизведения, чтобы начать автоматическую визуализацию заданных точек. Затем выполните анализ данных для каждой стратификации кожи, импортировав изображение липидов сальных желез на Фиджи и установив флажок Разделенные каналы, чтобы разделить файл на каналы CARS и SRS.
Чтобы открыть интересующий регион или менеджер ROI, нажмите «Анализ», «Инструменты» и «Менеджер окупаемости инвестиций». Используя канал SRS таким образом, чтобы C был равен единице, очистите сальную железу на изображении и добавьте маркировку в менеджер ROI, нажав кнопку Добавить T в диспетчере ROI. Повторите процесс для каждой сальной железы на изображении.
Чтобы замаскировать богатые липидами области, выберите каждую рентабельность инвестиций и нажмите кнопку Дополнительно, ИЛИ Объединить и Добавить вкладки. Чтобы замаскировать бедные липидами области, используйте инструмент «Прямоугольник» в меню «Фиджи» и нарисуйте квадрат вокруг всего изображения. Добавьте регион в менеджер ROI.
Нажмите на недавно добавленную квадратную рентабельность инвестиций в дополнение к ROI, которая выбирает все богатые липидами регионы в менеджере ROI. В разделе Дополнительно выберите XOR, чтобы создать маску областей с низким содержанием липидов и добавить ее в диспетчер окупаемости инвестиций. Объединяйте изображения в числовом порядке, перейдя в раздел «Изображение», «Стеки», «Инструменты» и объединив вкладки по порядку.
Кроме того, можно импортировать изображения, загрузив одно из них на Фиджи, а затем выбрав параметр Групповые файлы с похожими именами на странице настройки. Активируя сцепленное изображение, перейдите в диспетчер окупаемости инвестиций, чтобы выбрать области, богатые липидами, и перейдите на вкладку Дополнительно, прежде чем выбрать Multi Measure, а затем дождитесь появления окна Результаты. В окне Результаты экспортируйте данные в электронную таблицу и добавьте столбец с названием Регион, чтобы добавить богатые липидами области в каждую строку данных.
Добавляйте бедные липиды в области, которые были вне липидов. Чтобы визуализировать данные, сохраните и импортируйте электронную таблицу в пакет R, ggplot2. Затем постройте график данных как функцию от числа изображения по сравнению со средней интенсивностью, чтобы оценить данные о времени концентрации.
Выполните некомпарментальный анализ или NCA в RStudio на данных о времени интенсивности, импортированных из электронной таблицы с вызовом одного слоя. Когда все будет готово, постройте график и визуально сравните показатели Jmax и AUCflux. Кроме того, проводят статистические сравнения по экспериментальным условиям.
Репрезентативный анализ изображает роговой слой, сальные железы, адипоциты, подкожный жир из кожи уха обнаженной мыши и роговой слой, сосочковую дерму и сальную железу из кожи человека. В обнаженной мышиной коже уха ограниченное движение тканей сальных желез наблюдалось с одинаковой глубиной тканей желез в момент применения препарата и через 120 минут после применения. Существенное движение тканей в коже показало едва заметные сальные железы после 120 минут применения препарата, демонстрируя неэффективность первоначального протокола.
В нескольких исследованиях профили интенсивности по сравнению со временем показали высокие начальные концентрации, за которыми следовали снижение концентраций, что указывает на отсутствие дальнейшего всасывания препарата в ткань. С другой стороны, некоторые исследования показали повышение интенсивности, которая позже снизилась в течение экспериментальной продолжительности, демонстрируя, что поток в ткань не достиг максимума до визуализации. Анализ NCA профилей концентрации-времени двух составов для одного и того же API показал, что этокси-этоксиэтанол обеспечивает расширенное проникновение API по сравнению с гелевым составом независимо от слоя кожи.
Анализ общего воздействия между одними и теми же составами показал аналогичные наблюдения в более глубоких слоях кожи. Подготовка кожи человека и правильное размещение кожи на стеклянной нижней чашке после применения препарата имеют решающее значение для успеха эксперимента. Четкие решения здесь продемонстрировали пригодность этой методологии.
Дальнейшие исследования будут включать в себя продаваемые составы, такие как кремы, чтобы понять, как состав влияет на проникновение API и проникновение.
