Этот протокол предоставляет средства для культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков. Это легко разработать гигантские пузырьки, и только очень небольшой объем образца раствора требуется для подготовки пузырьков. Демонстрацией процедуры будет кандидат медицинских наук из нашей лаборатории, кандидат медицинских наук, доктор медицинских наук,
Начните с добавления 20 микролитров свежеприготовленного раствора POPC и четырех микролитров свежеприготовленного раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянный флакон. Испарять органический растворитель потоком воздуха до формирования липидной пленки. Поместите пленку в децикатор в течение одного часа, чтобы полностью испарять органический растворитель.
Затем добавьте в флакон 200 микролитров минерального масла. Обложка открытия флакона с пластиковой парафиновой пленкой, и sonicate содержимое флакона в ультразвуковой ванне на 120 Вт, по крайней мере один час. Для небольшой подготовки пузырьков создайте липидную пленку, как только что продемонстрировано, и добавьте к пленке 200 микролитров глюкозы 200 миллиметров глюкозы в среде LB.
Затем sonicate пленки на 120 Вт, по крайней мере час, а затем экструзии в результате гигантских пузырьков в небольших пузырьков с помощью мини экструдера и поликарбонатной мембраны с 100-нанометровой поры размера. Для бактериальных клеток до культуры, привить E.coli из пластины LB в миллилитров LB среды для ночной культуры при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро перенесите 20 микролитров супернатанта культуры на 1,98 миллилитров свежей среды LB еще на два часа культуры.
В конце инкубации проверьте оптическую плотность на 600 нанометров, или значение OD 600, до культурного раствора на спектрофотометре. Следует использовать до культурное решение с OD 600 от одного до 1,5. Затем смешайте предварительное решение с свежеприготовленным раствором сахарозы и свежей средой LB, согласно таблице 1.
Для формирования гигантских пузырьков добавьте 50 микролитров свежеприготовленного внешнего акуса раствора гигантских пузырьков в 1,5 миллилитровую пластиковую трубку. Аккуратно слой 150 микролитров липидсодержащего раствора масла над внешним aqueous раствором гигантских пузырьков. Инкубировать полученный раствор в течение 10-15 минут при комнатной температуре, прежде чем проверить, что интерфейс масла и aqueous решения плоские.
Для воды и масла бактериальной клетки, содержащей образование капель, добавьте два микролитера свежеприготовленного внутреннего акального раствора гигантских пузырьков в 50 микролитров звукового липидосодержащего раствора масла в 0,6 миллилитровую пластиковую трубку. Затем коснитесь трубки, чтобы эмульгировать два компонента. Далее используйте пипетку, чтобы добавить 50 микролитров раствора капли воды и масла к интерфейсу масла и аквозного раствора, и отсадить бактериальные клетки, содержащие гигантские пузырьки центрифугации.
Затем аспирировать верхний слой масла и собирать гигантские пузырьки. Чтобы подготовить камеру ручной работы, просверлите семимиллиметровое отверстие с полым пуншом на 10 на 10 на один миллиметр двулицый уплотнитель, а затем вставьте двулицую печать на стекло крышки размером 30 на 40 миллиметров. Чтобы подготовить поддерживаемую двухслойную мембрану, добавьте 30 микролитров раствора маленького везикула в отверстие камеры ручной работы.
Инкубировать пузырьки при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце инкубации, аккуратно мыть отверстие два раза с 20 микролитров LB среды, дополняется 200 миллимиллер глюкозы. Чтобы обездвижить гигантские пузырьки на поддержке двухслойной мембраны, ввейте 10 микролитров нейтравлина во внешнемтельном растворе гигантских пузырьков в отверстие для 15-минутной инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации аккуратно промыть отверстие два раза с помощью 20 микролитров среды LB, дополненных глюкозой 200 миллимиллеров, и добавить весь объем раствора гигантских пузырьков в отверстие в камере. Затем запечатайте отверстие стеклом крышки размером 18 на 18 миллиметров. Для мониторинга роста бактерий в гигантских пузырьках выберите цель 40X на перевернутом микроскопе и поместите камеру на систему нагрева микроскопа.
Затем инкубировать бактериальные клетки, содержащие гигантские пузырьки в камере в статических условиях в течение шести часов при 37 градусах по Цельсию, захвата и записи изображений роста бактериальных клеток каждые 30 минут, с научной дополнительной полупроводниковой камеры оксида металла. Гигантские пузырьки, содержащие бактериальные клетки, как правило, варьируются в размерах от 10 до 30 микрометров. Для обоих размеров гигантских пузырьков, клетки E.coli проходят процессы удлинения и деления, при этом некоторые клетки E.coli растут до очень большого количества клеток в течение шести часов периода наблюдения.
Относительная частота гигантских пузырьков, содержащих один уровень клеток, составляет примерно 10% от полученных гигантских пузырьков, а гигантские пузырьки, инкапсулированные на уровне одной клетки, составляют примерно 50% гигантских пузырьков, содержащих бактериальные клетки. Стабильность масляно-водяного интерфейса важна для получения гигантских пузырьков, содержащих бактериальные клетки. Позаботьтесь, чтобы аспирировать масло тщательно до гигантской коррекции пузырьков.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как культура бактериальных клеток на уровне одной клетки в отдельных гигантских пузырьков. Наш метод бактериальной культуры является новым инструментом в микробиологии для культивирования неизвестных экологических бактерий для получения или анализа их метаболических продуктов.
