Измерение содержания гликогена в отдельных клетках и субклеточных организациях важно, потому что в большинстве типов клеток одиночные клетки по-разному адаптируются к изменяющимся физиологическим условиям и заболеваниям. Итак, основным преимуществом данной методики является очень высокое разрешение в просвечивающем электронном микроскопе. Это улучшает возможность иметь локализованные субклеточные структуры, а также в этом содержании в этой технике здесь важно, чтобы окрашивание гликогена не содержало антител.
Таким образом, у нас нет никакой специфики, о которой нужно беспокоиться. Для того, чтобы получить лучший контраст на гликогене, просто используйте ферроцианид калия 1,5% вместо ферроцианида калия. Готовят 1,6 миллилитра первичного фиксаторного раствора, добавляя 2,5% глутаральдегида в 0,1 молярный буфер какодилата натрия в двухмиллилитровой микроцентрификационной трубке.
Храните его при пяти градусах Цельсия в течение максимум 14 дней. Выделите небольшой образец из биопсии мышцы или целой мышцы, которая имеет максимальный диаметр в один миллиметр в любом направлении и длиннее продольно, чем поперечно. Поместите образец в трубку, содержащую холодный раствор первичной фиксации.
Храните его при пяти градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем промыть образец четыре раза в 0,1 молярном буфере какодилата натрия. Используя переносные пипетки, извлеките использованный буфер из трубки, оставив образец нетронутым, и добавьте свежий буфер.
После фиксации образца с 1% тетроксидом осмия и 1,5% ферроцианида калия в 0,1 молярном буфере какодилата натрия в течение 120 минут при четырех градусах Цельсия. Дважды промойте образец в двойной дистиллированной воде комнатной температуры. Обезвоживание путем погружения в градуированную серию этанола при комнатной температуре.
Инфильтрировать образец градуированными смесями оксида пропилена и эпоссидной смолы при комнатной температуре с использованием указанных объемных соотношений. На следующий день встраивают образцы в 100% свежую эпоссидную смолу в формы и полимеризуют при 60 градусах Цельсия в течение 48 часов. Установите блок образца на держатель ультрамикротома.
Обрежьте блок на поверхности лезвием бритвы, чтобы достичь уровня ткани. Установите алмазный нож перед образцом и выровняйте поверхность образца параллельно ножу. Изготовьте полутонкий срез толщиной в один микрометр алмазным ножом для проверки ориентации образца.
Окрашивание полутонкого сечения толуидиновым синим цветом для наблюдения с помощью световой микроскопии. Затем обрежьте блок дальше, чтобы уменьшить интересующую область, чтобы получить правильные ультратонкие участки. Режете ультратонкие сечения толщиной от 60 до 70 нанометров вторым алмазным ножом.
Соберите одну-две секции на одной цельной медной сетке, используя идеальную петлю. Для контрастирования секций погружают сетки в раствор уранилацетата на 20 минут и промывают сетки в двойной дистиллированной воде, а затем погружают сетки в цитрат свинца на 15 минут и повторно промывают сетки в двойной дистиллированной воде. Включите компьютер просвечивающего электронного микроскопа и программное обеспечение для записи изображений, записывайте цифровые изображения с помощью цифровой ПЗС-камеры с медленным сканированием и соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.
После вставки сетки с несколькими секциями в стадии микроскопа, сначала экранируйте сетку при небольшом увеличении, чтобы выбрать наиболее качественные участки и определить направление мышечных волокон. Далее фокусируют изображение при увеличении выше 30 000 с пучком, центрированным на периферийном волокне в сечении и записывают изображения с одним секундным временем экспозиции при нужном увеличении. Убедитесь, что изображения распределены по длине и ширине волокна в систематическом порядке рандомизированного бота для получения объективных результатов и повторяют изображение до тех пор, пока не будет получено изображение от шести до 10 волокон.
Импортируйте изображения в изображение J, нажав на файл с последующим открытием. Установите глобальный масштаб в соответствии с исходным размером изображения, щелкнув «Анализировать», а затем установите масштаб. Чтобы увеличить на 100%, нажмите на изображение, перейдите в масштаб и нажмите на него.
Измерьте толщину одного Z-диска на образ миофибриллярного пространства с помощью инструмента «прямая линия» из меню инструментов и рассчитайте среднюю толщину Z-диска каждого из шести-10 волокон. Используйте инструмент сегментированной линии для измерения длины самой внешней миофибрюли, видимой чуть ниже субсарколеммальной области. Чтобы вставить сетку, нажмите «Анализ», выберите инструменты, а затем выберите сетку.
Теперь установите площадь на точку в 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий в пределах доступной длины на 12 субсарколеммальных изображениях, где крест попадает в субсарколеммальный гликоген. Вставьте сетку, щелкнув по анализу, затем выберите инструменты, затем сетку и установите площадь на точку в 160 000 квадратных нанометров.
Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном изображении, где крест попадает во внутримиофибриллярное пространство. Затем, чтобы вставить сетку, нажмите на анализ, выберите инструменты, а затем выберите сетку. Теперь установите площадь на точку в 3 600 квадратных нанометров.
Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном снимке, где крест попадает в интрамиофибриллярный гликоген. Вставьте сетку, щелкнув по анализу, затем выберите инструменты, затем сетку и установите площадь на точку в 32 400 квадратных нанометров. Подсчитайте количество попаданий на 12-м миофибриллярном снимке, где крест попадает в межмиофибриллярный гликоген.
Используя сетку площадью 32 400 квадратных нанометров, чтобы случайным образом выбрать частицы гликогена, начните с верхнего левого квадрата и при необходимости переместитесь влево. Используя инструмент прямой линии, измерьте диаметр пяти случайно выбранных частиц гликогена каждого бассейна для каждого из 12 изображений, чтобы получить в среднем 60 частиц на пул на волокно. На этом рисунке показаны нормальные значения трех пулов гликогена.
Можно наблюдать, что значения межмиофибриллярного гликогена распределены близко к норме, тогда как как внутримиофибриллярный, так и субсарколеммальный гликоген показывают искаженное распределение, где волокна иногда имеют чрезмерное количество гликогена. Среди всех шагов очень важно использовать ферроцианид калия. Анализ гликогена может быть объединен с анализом митохондрий и липидных капель, что может улучшить наше понимание того, как другие ключевые метаболические компоненты коррелируют с гликогеном и здоровьем мышц.
