This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Штаммы, культура, и микроскопия <ol><li> Обращении и обслуживании штаммы C. Элеганс, как описано выше 19. Штаммы доступны из генетики Центра Caenorhabditis (CGC). ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, используемые в этих экспериментах были CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-LacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) я; он-8 (e1489) IV) с GFP слитых белков, локализованных в митохондриях и ядрах; PJ727 (jls01 (мио-3 :: GFP, рол-6 (su1006)); UNC-54 :: LacZ V) с GFP слитых белков, локализованных в сократительного аппарата и PD55 (ccIs55 (SUP-7 (СТ5); unc- 54 :: LacZ) V) с β-галактозидазы слитых белков, локализованных в цитоплазме. </li><li> Полные эксперименты РНК-интерференции, как ранее описанные для разных поколений экспериментов RNAi 13 и получить RNAi бактерии из последовательности проверяется библиотеку ORF-RNAi построенный Марком Видаль и др. 12. </li><li> Построить штаммов, содержащих &lt;EM&gt; ИССА 4251, jls01 или ИССА 55 с использованием стандартных методов 20. Используйте эти трансгены создать напряжение для оценки митохондриальной структуры сети, миозин организацию или состояние proteostasis, соответственно. Крест штаммов в мутанта, где на одной из этих субклеточных отсеков в желании каждое животное. </li><li> Использование ингибитора PtdIns-3-киназы, LY-294002 (LY), как описано выше 21. Вкратце, добавить LY-294002, в конечной концентрации 160 мкМ в верхней части сухих OP50 семенами NGM пластин. </li><li> Захват всех изображений с использованием GFP фильтр для GFP основе экспериментов и микроскоп с тройным фильтром, который позволяет визуализации красного, зеленого и синего каналов одновременно для оценки в естественных условиях мембранного потенциала с C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, обычно продается как Mitotracker Красной CMXRos. Провести анализ изображения и подготовку рисунок в программное обеспечение для обработки изображений. </li></ol><ol><li> Минимум 1 сутки до необходимости сделать M9 буфер - 22,04 мМ KH 2 PO 4, 42,27 ммоль Na 2 HPO 4, 85,56 ммоль NaCl (конечные концентрации), и стерилизовать в автоклаве. После охлаждения до 45 ° С, добавить стерильный MgSO 4 до 1 мМ, после обработки в автоклаве, чтобы предотвратить осаждение 22. Разрешить М9 остыть при 4 ° С и аликвоты в 50 мл пробирки. </li><li> В день эксперимента, добавить 3 мл M9 буфер с одной пластиной 9 см с большим числом L1 личинок. Промыть пластины многократно путем аспирации жидкости M9 и пипетирования против поверхности агара с пластиной держать под углом. </li><li> Промыть L1 от пластины, а затем передать M9 в пробирку на 10 мл с помощью пипетки. </li><li> Оставьте в течение 2,5 мин, чтобы позволить большей взрослых и более поздние стадии личинки животных, чтобы упасть на дно пробирки и мелкие животные L1 остаются вблизи топ буфера M9. </li><li> Удалить верхние 500 мкл M9 в пробирке с помощью пипетки. Затем пипетки М9, содержащей L1 личинок на новый NGM пластины затравку 500 мкл OP50 с помощью препаровальной лупы. </li><li> Как правило, цель перенести ~ 200-300 L1 личинок на чашку. Монитор пластин ежедневно с взрослой жизни и, при необходимости, выбрать животных на свежих OP50 NGM пластин для предотвращения источником питания OP50 потребляется. Примечание: Это, как правило, 1-3 капли M9 с использованием пипетки P1000, хотя это зависит в значительной степени в зависимости от количества L1 на исходной пластине. </li><li> Если перспективные исследования в отдельных животных желательны, когда животные достигают совершеннолетия, подобрать индивидуальные животных отделить сеяных NGM пластин. Передача животных каждый 24-48 ч, чтобы отделить от личинок животных. </li></ol> 3. Движение Анализы 19 <ol><li> Минимум 2 ч до начала экспериментов, удалить 50 мл аликвоты M9 и позволить, чтобы уравновесить до комнатной температурытературы. </li><li> Pick одну взрослое животное в 50 мкл буфера М9 на предметное стекло микроскопа. </li><li> Подсчитайте количество левых и вправо изгибов тела в 10 сек, где один влево и один вправо изгиб равна одним ударом. </li><li> Повторите подсчет ударов тела, чтобы дать в общей сложности не менее 5 измерений, из которых в среднем может быть принято. Умножьте эти цифры на шесть, чтобы дать скорость движения в минуту. </li><li> С помощью пипетки, передать животное обратно в чашку Петри. Этот метод позволяет временную измерение движения на протяжении всего срока службы в С. elegan с. </li></ol><img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Рисунок 1: Движение анализы. После того, как черви собирают в буфер, один влево (A) и один вправо (B) изгиб добавляются вместе, чтобы дать один полный движение(Инсульт). 4. Визуализация митохондриальных сетей и саркомеры в орган Уолл Muscle <ol><li> ПРИМЕЧАНИЕ: В тот же протокол применяется для визуализации как митохондрии и саркомерах. </li><li> Синхронизация червей, как описано выше (раздел 1) и расти в течение 48-60 ч при 20 ° С, когда они достигнут молодом возрасте. </li><li> Выберите 20 червей (представитель пластины) из пластин в 20 мкл M9 на предметное стекло. </li><li> Нанесите покровное и перейти к изображению с помощью флуоресцентного микроскопа под GFP фильтр (460-500 нм, синий возбуждения свет) в 40-кратном увеличении. </li></ol> 5. Оценка мембранного потенциала с помощью в естественных условиях Накопления Пробирной с Mitotracker Красной CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol><li> Синхронизация CB5600 (раздел 1), все помечены GFP в митохондриях мышц, и расти, чтобы в начале взрослой жизни на NGM содержащей OP50 для 48-60 часов при температуре 20 ° С. </li><li> Добавить 100 мкл ДМСО к 50 мкг аликвотой C 32 H 32 Cl 2 N 2 O с получением концентрированного раствора 940,692 мкМ. </li><li> Принимать по 1 мкл исходного раствора 940,692 мкМ и ресуспендируйте в 199 мкл M9 создать рабочий раствор 4,70 мкМ (4,70346 мкм). Подготовить этот в коричневых 1,5 мл пробирки, потому что C 32 H 32 Cl 2 N 2 O является светочувствительная. </li><li> Подготовка 20 мкл аликвоты 4,70 мкМ рабочий раствор (20 взрослых червей в 20 мкл аликвоты). </li><li> Выберите 20 взрослых животных в 20 мкл 4,70 мкМ С 32 Н 32 Cl 2 N 2 O в коричневых 1,5 мл пробирки. Инкубируют при 20 ° С в течение 1 часа. </li><li> После 1 ч инкубации, добавить 1 мл M9 с коричневыми 1,5 мл пробирки, содержащие червей, центрифуги в 2000 мкг в течение 10 сек, а затем удалите супернатант. Повторите эту стирки шаг до ресуспендированием червя осадок и передачи оставшихся 20 μл (содержащий червей) на слайде для визуализации. </li><li> Возьмите образы митохондриях с 40-кратном увеличении, используя тройной фильтр, который позволяет визуализировать обе красные, синие и зеленые каналов одновременно. Изображений с использованием тройной фильтр показывает совместной локализации C 32 H 32 Cl 2 N 2 O с GFP локализованный в митохондриях, появляющихся как апельсин. </li><li> Приняв образ оранжевой митохондрий, фото-отбеливание животное в течение 10 сек, используя свет с длиной волны 540/25-нм на максимальных настройках со всеми снятыми фильтрами. Это будет отбеливать красный внутри митохондрий и выявить митохондриальную GFP в покое, чтобы подтвердить колокализацию в мышечных митохондрий. </li></ol> 6. Оценка мышечного белка деградации в С. Элеганс <ol><li> Синхронизация PD55s (или любой штамм, содержащий трансген LacZ) на на NGM пластин затравку OP50 (раздел 1). Растут в молодом возрасте для 48-60 часов при 2От 0 ° C. </li><li> Pick 20 взрослых червей в 20 мкл DDH 2 O на предметное стекло микроскопа. Будьте осторожны, чтобы попытаться выбрать только червя, а не любые бактерии с выбором. Этикетка микроскопа карандашом. </li><li> Поместите в эксикаторе в течение 30 мин, чтобы высушить и трещины кутикулу животных. Убедитесь, герметичное уплотнение на эксикаторе с использованием смазки вокруг уплотнения. </li><li> Проверьте усыхание был эффективным при вскрытии рамки (рисунок 2). </li><li> Погрузите стекло микроскопа в ледяной ацетоне в течение 3,5 мин затем оставить стекло микроскопа на бумажном полотенце при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы позволить ацетон на слайде испаряться. В этот момент растопить X-Gal и окислению буфер и позволяют уравновешивания до комнатной температуры. </li><li> Добавить 2 мкл X-гал до 100 мкл буфера окисления и вихря осторожно, чтобы обеспечить это однородная. Это X-гал / окисления буфер мастер микс. </li><li> Добавить 20 мкл X-гал / окисления буфер мастер микс друг опервоначально оплащенной площадью 20 червей. Осмотр с помощью препаровальной лупы, чтобы обеспечить Master Mix полностью охватывает все животные полностью. Осторожно наклоните стекло микроскопа для перемещения основной смеси над районами, где животные не распространяется. </li><li> Поместите стекло микроскопа во влажной камере в течение 1-2,5 ч при 20 ° С. Image животные, когда темно-синий цвет присутствует в стенки тела мышц контрольных животных. Оценка контрольных животных с помощью препаровальной лупы каждые 15 мин, чтобы определить, когда животные должны быть отображены. </li></ol><img alt="Рисунок 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Рисунок 2: Оценка деградации белков мышечной использованием β-галактозидазы анализов. (A) Животные, содержащие LacZ трансген собирают с чашек Петри с 20 мкл DDH 2 O на слайде микроскопии (B). Животные обезвоживанию и стать перелом <sЧонг&gt; (C). Животных затем промывают в ацетоне (D). После того, как ацетон испаряется X-гал / окисление буфер Master Mix добавляется (Е). Развитие синего цвета у контрольных животных не оценивали с интервалом 15 мин (FL) с Т = 0 мин (F), пока синий цвет получается по всей длине животных (L). Изображения червей принимаются на 2.5 x увеличение в AE и 8X в штат Флорида. Наезд C, D, F, G и L являются 4X оригинал увеличения.

The authors have nothing to disclose.

Мышцы это многофункциональный ткани, хорошо оценили за его роль в двигательной, постуральной поддержки и обмена веществ. Развитие и поддержание здорового мышцы требует координации нескольких клеточных процессов и компонентов. Либо через повреждение или болезнь, нарушение регуляции может произойти, в результате чего измененной структурой и / или мышечной функции. Связанное с возрастом снижение функции мышц представляет собой значительную нагрузку на бюджеты здравоохранения в западном мире, так как мышечная масса 1,2 и особенно мышечная сила и выносливость 3-5 отрицательную корреляцию со смертностью. Измерение аспектов, связанных с ухудшением функции мышц, такие как измененное митохондриальной функции или нарушения саркомера, может позволить большее понимание механизмов, лежащих в основе общего развития и здоровья мышц. С aenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является микроскопические нематоды бест известно, потому что это был первый многоклеточный организм, чтобы иметь весь его геном последовательность 6, первый есть гены замолчать с помощью РНК-интерференции 7, и только метазоа иметь свои Вся клональные клеток 8 и нейроанатомии 9 определяется. C. Элеганс впервые была предложена в качестве модель для изучения генетического контроля поведения в 1974 году Сидней Бреннер 10 и важности этого и последующих работ была признана с первым из трех Нобелевских премий, присужденных C. Элеганс исследователей. Около 35% C. Элеганс гены определили ортологи в людях, с C. Элеганс является ключевым организм используются для понимания генетического контроля развития мышц 11. Почти каждый ген в C. Элеганс генома может быть сбит с помощью РНК-интерференции 7,12. Таким образом, сбивая генов в полностью развитой мышцы, генетические компоненты вклад в реgulation здоровья мышц могут быть исследованы с относительной простотой 13. Комбинированный Возможность использования RNAi, мутанты, и химические соединения делает C. Элеганс ведущим системы для изучения генетической регуляции 7,14,15 структуры и функции мышц с возрастом 16 и в моделях болезни 17. Воздействие генной мутации нокдауна, и / или воздействием химических соединений от структуры и / или функции мышц может быть измерена с помощью нескольких аспектах. Здесь мы кратко опишем простые методы для оценки C. Элеганс структуру и функцию мышц, многие из которых могут быть использованы в перспективных исследований здоровья мышц. Развитие зеленого флуоресцентного белка (GFP), 18 позволила визуализировать как местности специфических белков и общей структуры органелл в C. Элеганс. Здесь мы объясним, как GFP выразил специфичнуюfically в тела стены мышц митохондрий, ядра, или саркомеры может использоваться для определения того, дистрофия этих субклеточных структур присутствует. Как структура не всегда является надежным суррогатом функции, мы также объяснить, как использование катионных красителей в естественных условиях позволяет оценить нарушения митохондриального мембранного потенциала в мышцах. Когда красители используют в сочетании с GFP, они позволяют изучать архитектуру и функции в височной образом на протяжении срока службы. Наконец, мы также объяснить, как белка гомеостаз в мышцах может быть оценена и как все эти меры могут быть использованы для корреляции изменения в целый здоровья мышц животных посредством использования движения анализов. Эти методы, в сочетании с генной мутации, нокдаун, и / или химических соединений обеспечивают мощный арсенал для изучения того, как специфические гены или соединения влиять на здоровье мышц в естественных условиях. Параллели в структуре, метаболизме и валового функции мышцы между C. Элеганс имлекопитающие значит С. Элеганс представляет собой выдающийся пример организм для понимания регулирование мышцы у высших организмов, включая человека.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

Мышцы это динамичная ткань, которая реагирует на изменения в питании, физических упражнений и болезненного состояния. Потеря мышечной массы и функции с болезнью и возраста значительные тяготы здравоохранения. В настоящее время мы понимаем, немного о генетической регуляции здоровья мышц с заболеванием или возрастом. Нематода C. Элеганс является признанным образцом для понимания геномной регуляции биологических процессов, представляющих интерес. Стенки тела мышцы этот червь отображают большую степень гомологии с мышц высших многоклеточных видов. Поскольку C. Элеганс является прозрачным организм, локализация GFP в митохондриях и саркомерах позволяет визуализировать этих структур в естественных условиях. Аналогичным образом, кормление животных катионные красители, которые накапливаются на основе существования митохондриальной мембранного потенциала, позволяет оценить митохондриальной функции в живом организме. Эти методы, а также оценка из мышечного белка homeostaSIS, в сочетании с оценкой всей животной мышечной функции, в виде движения анализов, чтобы позволить корреляцию субклеточных дефектов с функциональных показателей эффективности мышц. Таким образом, С. Элеганс представляет собой мощную платформу, с помощью которой для оценки влияния мутаций, генной нокдаун, и / или химических соединений на структуру и функции мышц. И, наконец, как GFP, катионных красителей, а движение анализов оцениваются неинвазивно, перспективные исследования структуры и функции мышц может быть проведена на всей жизни, конечно, и это в настоящее время не могут быть легко исследованы в естественных условиях и в любом другом организме.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

методы оценки субклеточных компартментов мышц C. elegans | Биология | Видео

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Скелетных мышц имеет важное значение для передвижения и является основным магазин белок органов. Измерения здоровья мышц внутри C. Элеганс описаны. Предполагаемые изменения в структуре и функции мышц оцениваются с использованием локализованного GFP и катионные красители.

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

16.4K Views.  University of Nottingham.  Скелетных мышц имеет важное значение для передвижения и является основным магазин белок органов. Измерения здоровья мышц внутри C. Элеганс описаны. Предполагаемые изменения в структуре и функции мышц оцениваются с использованием локализованного GFP и ка...

Video: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на<em&gt; С. Элеганс</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Эмбрионы

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Измерение силы при сжатии для оценки функции мышц в личинки данио

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...