В этом протоколе JoVE мы используем секвенирование одноядерной РНК на основе капель для характеристики биологической архитектуры сердечных симпатических нейронов в здоровье и болезни. Этот метод позволяет секвенировать большую коллекцию образцов нейронов в течение определенного периода времени. Вытягивая ядра со штрих-кодом с хэштегом oligos, этот метод позволяет мультиплексировать образцы.
Этот метод обладает потенциалом для секвенирования нейронов человеческих ганглиев, что было сложной задачей из-за большого размера клеток и сложного одновременного сбора образцов. Продемонстрировать процедуру будут Конни ван Мюнстерен, техник-исследователь, и Лике ван Роон, аспиранты из нашей лаборатории Начните со сбора всех материалов, необходимых для вскрытия, а затем зафиксируйте мышь на рассеченной доске. Смочите мышь 70% этанолом, чтобы свести к минимуму диспергирование шерсти.
Откройте кожу области шеи, сделав ножницами разрез средней линии. Под стереомикроскопом отодвиньте подчелюстные железы в сторону и удалите грудинную сосцевидную мышцу, чтобы обнажить общую сонную артерию и ее бифуркацию, а также верхние шейные ганглии и удалить прикрепленную к ней ткань. Рассекают бифуркацию правой и левой сонной артерии и прикрепленную к ней ткань.
Переложите каждый рассеченный кусочек ткани в отдельную 3,5-сантиметровую чашку Петри, содержащую холодный PBS. Найдите верхние шейные ганглии, прикрепленные к бифуркации сонной артерии. Очистите верхние шейные ганглии, удалив артерию и прикрепленную ткань.
Чтобы рассечь звездчатые ганглии, делают средний разрез в брюшной полости с последующим вскрытием диафрагмы и вентральной грудной стенки. Удалите легкие, а затем сердце, чтобы обнажить дорсальную грудную клетку. На уровне первого ребра расположите левую и правую звездчатые ганглии переднего ряда к мускулатурному колли длинному.
Рассекайте оба звездчатых ганглия с помощью щипцов, удаляя окружающие ткани. Переложите их на 3,5-сантиметровые чашки Петри, содержащие холодный PBS. Используя щипцы, перенесите верхние шейные ганглии и звездчатые ганглии в отдельные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, затем добавьте 500 микролитров 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждую трубку и высиживают на встряхивающей водяной бане.
Дайте ганглиям осесть на дне микроцентрифужных трубок. Переведите супернатант в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров ганглиозной среды. В микроцентрифужные трубки добавляют 500 микролитров раствора коллагеназы типа 2 и высиживают на встряхивающей водяной бане.
После инкубации повторно суспендируют ганглии в растворе коллагеназы путем пипетирования до тех пор, пока сгустки тканей больше не будут обнаружены. Перенесите клеточную суспензию в ранее использованную 15-миллилитровую трубку, содержащую питательную среду ганглия с трипсин-ЭДТА-суспензией. Центрифугируйте клеточную суспензию и выбросьте супернатант клетки.
Повторно суспендировать гранулу в 270 микролитрах фетальной бычьей сыворотки и перевести ее в 1-миллилитр криовиальной. Чтобы подсчитать клетки, смешайте 5 микролитров суспензии ганглионных клеток с пятью микролитрами 0,4% трипан-синего красителя. Загрузите смесь в гемоцитометр и подсчитайте общее и живое количество клеток под микроскопом.
Затем добавьте 30 микролитров диметилсульфоксида к каждому криовиалу и хорошо перемешайте. Переложите криовиалы в контейнер для замораживания клеток и поместите его при минус 80 градусах Цельсия на ночь. Подготовьте 15-миллилитровые трубки с 30-микрометровым ситечком сверху.
Предварительно промыть ситечко 1 миллилитром ганглиозной среды. Извлеките криовиалы из жидкого азота и немедленно разморозьте их на водяной бане при температуре 37 градусов цельсия, пока в криовиале не останется небольшая гранула льда. Добавьте 1 миллилитр ганглиозной среды в каждый криовиал, осторожно встряхивая флакон, чтобы восстановить ганглионарные клетки.
Загрузите суспензию ганглионных клеток на ситечко и промойте от 4 до 5 миллилитров ганглиозной среды. Центрифугировать суспензию процеженных клеток. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 микролитрах буфера промывки клеток.
Перенесите клеточную суспензию в 0,5-миллилитровую низкосвязанную микроцентрифужную трубку. Центрифугировать клеточную суспензию. Центрифуга с качающимся ротором ковша имеет важное значение с этого момента.
После центрифугирования удаляют 45 микролитров супернатанта, не смещая гранулу клетки. Добавьте 45 микролитров охлажденного буфера лизиса, аккуратно перемешав путем пипетки, и инкубируйте клетки в течение 8 минут на льду, затем добавьте 50 микролитров буфера промывки холодных ядер в каждую трубку. Центрифугируйте суспензию ядер и удалите 95 микролитров супернатанта, не нарушая гранулы ядер.
Добавьте 45 микролитров охлажденных ядер в гранулу, повторите центрифугирование и удалите супернатант. К грануле ядра добавить 50 микролитров ST-SB и аккуратно пипетку до полного повторного суспендирования ядер, затем добавить 5 микролитров реагента, блокирующего FC, и инкубировать в течение 10 минут на льду. Далее добавляют 1 микролитр одноядерного хэштега антитела и инкубируют в течение 30 минут на льду.
После инкубации добавьте в каждую трубку 100 микролитров ST-SB. Центрифугируйте суспензию и удалите 145 микролитров супернатанта, не нарушая гранулы ядер. Повторите центрифугирование и удалите супернатант.
Повторно суспендировать гранулы ядер в 50 микролитрах ST-SB и аккуратно перемешать. Возьмите 5 микролитров суспензии ядер и смешайте ее с 5 микролитрами 0,4% трипанового синего цвета, чтобы подсчитать ядра под микроскопом. Опять же, центрифугируют суспензию ядер и повторно суспендируют гранулу ядер в ST-SB для достижения целевой концентрации ядер от 1000 до 3000 ядер на микролитр.
Потяните образцы, чтобы достичь нужного количества ячеек. Анализ контроля качества для подготовки библиотеки показал хэштег олиго-производных cDNAs менее 180 пар оснований. Широкий пик от 300 до 1000 пар оснований представлял собой высококачественную библиотеку экспрессии генов, тогда как конкретный пик из 194 пар оснований показывал библиотеку олиго хэштегов.
Анализ секвенирования одноядерной РНК выявил 12 кластеров, которые были визуализированы UMAP, и антитела с хэштегом были распределены между всеми кластерами. Специфическая маркировка хэштегом oligos была подтверждена выражением Xist. Хэштеги от 1 до 4 помечены как женские, в то время как от 5 до 8 помеченных мужских образцов.
Качество и разрешение данных секвенирования были проверены ключевыми транскриптами, такими как TH, DBH и SNAP25 в кластерах 5 и 7 для симпатических нейронов, S100B в кластерах от 0 до 3 для спутниковых глиальных клеток, PECAM 1 в кластере 4 для эндотелиальных клеток и ACTA2 в кластере 8 для стромальных клеток. При попытке использования этого метода важно помнить о правильной подготовке и адекватном оборудовании, таком как тонкие ножницы для рассечения, острый пинцет и центрифуга с качающимся ротором ковша. Поэтапный подход к секвенированию одноядерной РНК симпатических внешних сердечных ганглиев имеет потенциал для широкого применения в характеристике ганглиев, иннервирующих другие родственные органы и ткани в области здоровья и болезни.
