Bu JoVE protokolünde, sağlık ve hastalıkta kardiyak sempatik nöronların biyolojik mimarisini karakterize etmek için damlacık bazlı tek çekirdekli RNA dizilimini kullanıyoruz. Bu yöntem, belirli bir süre boyunca geniş bir nöronal örnek koleksiyonunun sıralanmasını sağlar. Hashtag oligolarla barkodlanmış çekirdekleri çekerek, bu yöntem örneklerin çoklanmasını sağlar.
Bu yöntem, büyük hücre boyutu ve zor eşzamanlı numune toplanması nedeniyle zor olan insan gangliyonlarının nöronlarını dizilemeye kadar genişletilme potansiyeline sahiptir. Prosedürü gösteren Conny van Munsteren, araştırma teknisyeni ve Lieke van Roon, laboratuvarımızdan doktora öğrencileri Diseksiyon için gerekli tüm malzemeleri toplayarak başlayın, ardından fareyi diseksiyon panosuna sabitleyin. Kürk dağılımını en aza indirmek için fareyi% 70 etanol ile ıslatın.
Makasla orta hat kesimi yaparak boyun bölgesinin derisini açın. Bir stereo mikroskop altında, sub-mandibuler bezleri bir kenara taşıyın ve ortak karotis arteri ve bifurkasyonunu ve ayrıca üstün servikal ganglionları ortaya çıkarmak için sternal mastoid kası çıkarın ve ona bağlı dokuyu çıkarın. Sağ ve sol karotis arter bifurkasyonunu ve ona bağlı dokuyu diseke edin.
Disseke edilen her doku parçasını soğuk PBS içeren ayrı bir 3,5 santimetrelik Petri kabına aktarın. Karotis bifurkasyonuna bağlı superior servikal ganglionları bulun. Arteri ve bağlı dokuyu çıkararak superior servikal ganglionları temizleyin.
Yıldız gangliyonlarını diseke etmek için, karında bir orta hat kesimi yapın, ardından diyaframı ve ventral torasik duvarı açın. Dorsal toraksı ortaya çıkarmak için akciğerleri, ardından kalbi çıkarın. İlk kaburga seviyesinde, sol ve sağ yıldız gangliyonlarını musculus colli longus'a anterolateral olarak yerleştirin.
Her iki yıldız gangliyonu forseps ile çevre dokuyu çıkararak disseke edin. Bunları soğuk PBS içeren 3,5 santimetrelik Petri kaplarına aktarın. Forseps kullanarak, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerini ayırmak için üstün servikal ganglionları ve yıldız gangliyonlarını aktarın, ardından her tüpe 500 mikrolitre% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve çalkalanan bir su banyosunda inkübe edin.
Ganglionların mikro santrifüj tüplerinin dibine yerleşmesine izin verin. Süpernatantı beş mililitre ganglion ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Mikro santrifüj tüplerine, 500 mikrolitre kollajenaz tip 2 çözeltisi ekleyin ve çalkalanan bir su banyosunda inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, doku kümeleri artık tespit edilinceye kadar pipetleme yaparak gangliyonları kollajenaz çözeltisinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu, Tripsin-EDTA süspansiyonlu gangliyon kültür ortamını içeren daha önce kullanılan 15 mililitrelik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre süpernatını atın.
Peleti 270 mikrolitre fetal sığır serumunda askıya alın ve 1 mililitrelik bir kriyoliyal içine aktarın. Hücreleri saymak için, gangliyonik hücre süspansiyonunun 5 mikrolitresini% 0.4 tripan mavisi boyadan oluşan beş mikrolitre ile karıştırın. Karışımı bir hemositometreye yükleyin ve mikroskop altında toplam ve canlı hücre sayılarını sayın.
Daha sonra, her kriyovale 30 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin ve iyice karıştırın. Kriyovalleri hücre dondurucu bir kaba aktarın ve gece boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Üstünde 30 mikrometrelik bir süzgeç bulunan 15 mililitrelik tüpler hazırlayın.
Süzgeci 1 mililitre ganglion ortamı ile önceden durulayın. Kriyovalleri sıvı azottan çıkarın ve kriyovyalde küçük bir buz topağı kalana kadar derhal 37 santigrat derecede bir su banyosunda çözün. Gangliyonik hücreleri kurtarmak için şişeyi dikkatlice sallarken her kriyovyalin içine 1 mililitre ganglion ortamı ekleyin.
Gangliyonik hücre süspansiyonunu süzgeç üzerine yükleyin ve 4 ila 5 mililitre ganglion ortamı ile durulayın. Gergin hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 50 mikrolitre hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonunu 0,5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Sallanan kova rotoruna sahip bir santrifüj bundan sonra çok önemlidir.
Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini yerinden çıkarmadan süpernatantın 45 mikrolitresini çıkarın. Pipetleme ile nazikçe karıştırılmış 45 mikrolitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin ve hücreleri buz üzerinde 8 dakika inkübe edin, ardından her tüpe 50 mikrolitre soğuk çekirdek yıkama tamponu ekleyin. Çekirdek süspansiyonunu santrifüj edin ve çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 95 mikrolitresini çıkarın.
Pelet üzerine 45 mikrolitre soğutulmuş çekirdek yıkama tamponu ekleyin, santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın. Çekirdek peletine, çekirdekler tamamen askıya alınana kadar 50 mikrolitre ST-SB ve hafifçe pipet ekleyin, ardından 5 mikrolitre FC bloke edici reaktif ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, 1 mikrolitre tek çekirdekli hashtag antikoru ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, her tüpe 100 mikrolitre ST-SB ekleyin. Süspansiyonu santrifüj edin ve çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 145 mikrolitresini çıkarın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın.
Çekirdek peletini 50 mikrolitre ST-SB içinde yeniden askıya alın ve yavaşça karıştırın. Çekirdek süspansiyonunun 5 mikrolitresini alın ve çekirdekleri mikroskop altında saymak için 5 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Yine, çekirdek süspansiyonunu santrifüj edin ve mikrolitre başına 1.000 ila 3.000 nükleer hedef çekirdek konsantrasyonu elde etmek için ST-SB'deki çekirdek peletini yeniden askıya alın.
İstenilen hücre sayısına ulaşmak için örnekleri çekin. Kütüphane hazırlığı için kalite kontrol analizi, 180 baz çiftinden daha küçük hashtag oligo türevi cDNA'ları gösterdi. 300 ila 1.000 baz çifti arasındaki geniş bir zirve, yüksek kaliteli bir gen ekspresyon kütüphanesini temsil ederken, 194 baz çiftinin belirli bir zirvesi hashtag oligo kütüphanesini gösterdi.
Tek çekirdekli RNA dizileme analizi, UMAP tarafından görselleştirilen 12 kümeyi ortaya çıkardı ve hashtag antikorları tüm kümeler arasında dağıtıldı. Hashtag oligos tarafından yapılan spesifik etiketleme, Xist'in ifadesiyle doğrulandı. Hashtag'ler 1 ila 4 etiketli kadın, 5 ila 8 etiketli erkek örnekleri.
Dizileme verilerinin kalitesi ve çözünürlüğü, sempatik nöronlar için küme 5 ve 7'deki TH, DBH ve SNAP25, uydu glial hücreleri için 0 ila 3 kümelerindeki S100B, endotel hücreleri için küme 4'teki PECAM 1 ve stromal hücreler için küme 8'deki ACTA2 gibi anahtar transkriptlerle doğrulandı. Bu yöntemi denerken, uygun hazırlığı hatırlamak önemlidir ve ince diseksiyon makasları, keskin cımbızlar ve sallanan kova rotorlu bir santrifüj gibi yeterli ekipman gereklidir. Sempatik ekstrinsik kardiyak ganglionların tek çekirdekli RNA dizilimi için aşamalı yaklaşım, sağlık ve hastalıkta diğer ilgili organ ve dokuları innerve eden ganglionların karakterizasyonunda geniş uygulama potansiyeline sahiptir.
