In questo protocollo JoVE, utilizziamo il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo basato su goccioline per caratterizzare l'architettura biologica dei neuroni simpatici cardiaci in salute e malattia. Questo metodo consente il sequenziamento di una vasta collezione di campioni neuronali per un periodo di tempo. Tirando nuclei con codice a barre con hashtag oligos, questo metodo consente il multiplexing dei campioni.
Questo metodo ha il potenziale per essere esteso ai neuroni di sequenziamento dei gangli umani, che è stato difficile a causa delle sue grandi dimensioni cellulari e della difficile raccolta simultanea di campioni. A dimostrare la procedura saranno Conny van Munsteren, tecnico di ricerca, e Lieke van Roon, dottorandi del nostro laboratorio Begin raccogliendo tutti i materiali necessari per la dissezione, quindi fissando il mouse sulla scheda di dissezione. Bagnare il mouse con etanolo al 70% per ridurre al minimo la dispersione della pelliccia.
Apri la pelle della regione del collo facendo un taglio della linea mediana con le forbici. Sotto uno stereomicroscopio, spostare le ghiandole sotto-mandibolari da parte e rimuovere il muscolo mastoideo sternale per esporre l'arteria carotide comune e la sua biforcazione, così come i gangli cervicali superiori e rimuovere il tessuto attaccato ad esso. Sezionare la biforcazione dell'arteria carotide destra e sinistra e il tessuto ad essa collegato.
Trasferire ogni pezzo di tessuto sezionato in una capsula di Petri separata di 3,5 centimetri contenente PBS freddo. Individuare i gangli cervicali superiori attaccati alla biforcazione carotidea. Pulire i gangli cervicali superiori rimuovendo l'arteria e il tessuto attaccato.
Per sezionare i gangli stellati, fare un taglio della linea mediana nell'addome, seguito dall'apertura del diaframma e della parete toracica ventrale. Rimuovere i polmoni, seguiti dal cuore, per esporre il torace dorsale. A livello della prima costola, individuare i gangli stellati sinistro e destro anterolaterale al musculus colli longus.
Sezionare entrambi i gangli stellati con una pinza rimuovendo il tessuto circostante. Trasferirli in piastre di Petri da 3,5 centimetri contenenti PBS freddo. Usando la pinza, trasferire i gangli cervicali superiori e i gangli stellati in tubi di microcentrazione separati da 1,5 millilitri, quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% a ciascun tubo e incubare in un bagno d'acqua tremante.
Lasciare che i gangli si depositino sul fondo dei tubi della microcentrifuga. Trasferire il surnatante in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo gangliare. Ai tubi della microcentrghiera, aggiungere 500 microlitri di soluzione di collagenasi di tipo 2 e incubare in un bagno d'acqua tremante.
Dopo l'incubazione, risospese i gangli in soluzione di collagenasi mediante pipettaggio fino a quando i grumi di tessuto non vengono più rilevati. Trasferire la sospensione cellulare sul tubo da 15 millilitri precedentemente utilizzato contenente il terreno di coltura dei gangli con sospensione di tripsina-EDTA. Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il surnatante cellulare.
Risospesciare il pellet in 270 microlitri di siero bovino fetale e trasferirlo in un crioviale da 1 millilitro. Per contare le cellule, mescolare 5 microlitri della sospensione cellulare gangliare con cinque microlitri di colorante blu tripano allo 0,4%. Caricare la miscela in un emocitometro e contare il numero totale e di cellule vive al microscopio.
Quindi, aggiungere 30 microlitri di dimetilsolfossido a ciascun crioviale e mescolare bene. Trasferire i criocerali in un contenitore di congelamento cellulare e posizionarlo a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Preparare tubi da 15 millilitri con un filtro da 30 micrometri sulla parte superiore.
Pre-risciacquare il colino con 1 millilitro di mezzo ganglio. Estrarre i crioviali dall'azoto liquido e scongelarli immediatamente a bagnomaria a 37 gradi Celsius fino a quando un piccolo pellet di ghiaccio viene lasciato nella crioviale. Aggiungere 1 millilitro del mezzo gangliare in ogni crioviale mentre si agita attentamente il flaconcino per recuperare le cellule gangliari.
Caricare la sospensione di cellule gangliari sul filtro e risciacquare con 4-5 millilitri di mezzo gangliare. Centrifugare la sospensione a cellule tese. Rimuovere il surnatante e risospescere le cellule in 50 microlitri di tampone di lavaggio cellulare.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifiva a bassa legatura da 0,5 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare. Una centrifuga con rotore a benna oscillante è d'ora in poi essenziale.
Dopo la centrifugazione, rimuovere 45 microlitri del surnatante senza spostare il pellet cellulare. Aggiungere 45 microlitri di tampone di lisi refrigerato, delicatamente miscelati mediante pipettaggio, e incubare le cellule per 8 minuti sul ghiaccio, quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di lavaggio a nuclei freddi a ciascun tubo. Centrifugare la sospensione dei nuclei e rimuovere 95 microlitri del surnatante senza interrompere il pellet di nuclei.
Aggiungere 45 microlitri di tampone di lavaggio a nuclei refrigerati al pellet, ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Al nucleo pellet, aggiungere 50 microlitri di ST-SB e pipettare delicatamente fino a quando i nuclei non sono completamente risospesi, quindi aggiungere 5 microlitri di reagente bloccante FC e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 1 microlitro di anticorpo hashtag a nucleo singolo e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.
Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di ST-SB a ciascun tubo. Centrifugare la sospensione e rimuovere 145 microlitri del surnatante senza interrompere il pellet di nuclei. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.
Risospesciare il pellet di nuclei in 50 microlitri di ST-SB e mescolare delicatamente. Prendi 5 microlitri della sospensione dei nuclei e mescolali con 5 microlitri di 0,4% di tripano blu per contare i nuclei al microscopio. Ancora una volta, centrifugare la sospensione dei nuclei e risospescere il pellet di nuclei in ST-SB per raggiungere una concentrazione di nuclei target da 1.000 a 3.000 nuclei per microlitro.
Estrarre i campioni per ottenere il numero desiderato di celle. L'analisi del controllo di qualità per la preparazione della libreria ha mostrato cDNA oligo-derivati da hashtag inferiori a 180 coppie di basi. Un ampio picco da 300 a 1.000 coppie di basi rappresentava una libreria di espressione genica di alta qualità, mentre un picco specifico di 194 coppie di basi mostrava la libreria di hashtag oligo.
L'analisi del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo ha rivelato che 12 cluster visualizzati da UMAP e gli anticorpi hashtag sono stati distribuiti tra tutti i cluster. L'etichettatura specifica da parte di hashtag oligos è stata confermata dall'espressione di Xist. Gli hashtag da 1 a 4 sono etichettati come femminili, mentre da 5 a 8 sono etichettati come campioni maschili.
La qualità e la risoluzione dei dati di sequenziamento sono state verificate da trascrizioni chiave come TH, DBH e SNAP25 nei cluster 5 e 7 per i neuroni simpatici, S100B nei cluster da 0 a 3 per le cellule gliali satelliti, PECAM 1 nel cluster 4 per le cellule endoteliali e ACTA2 nel cluster 8 per le cellule stromali. Quando si tenta questo metodo, è importante ricordare la preparazione adeguata e l'attrezzatura adeguata come forbici a dissezione fine, pinzette affilate e una centrifuga con un rotore a benna oscillante sono essenziali. L'approccio graduale per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo dei gangli cardiaci estrinseci simpatici ha il potenziale per un'ampia applicazione nella caratterizzazione dei gangli che innervano altri organi e tessuti correlati in salute e malattia.
