Dans ce protocole JoVE, nous utilisons le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Cette méthode permet le séquençage d’une grande collection d’échantillons neuronaux sur une période de temps. En tirant des noyaux à code-barres avec des oligos hashtag, cette méthode permet le multiplexage des échantillons.
Cette méthode a le potentiel d’être étendue au séquençage des neurones des ganglions humains, ce qui a été difficile en raison de sa grande taille cellulaire et de la collecte simultanée difficile d’échantillons. Conny van Munsteren, technicienne de recherche, et Lieke van Roon, doctorante de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure En commençant par collecter tous les matériaux nécessaires à la dissection, puis en fixant la souris sur la carte de dissection. Mouiller la souris avec de l’éthanol à 70% pour minimiser la dispersion de la fourrure.
Ouvrez la peau de la région du cou en faisant une coupe médiane avec des ciseaux. Sous un stéréomicroscope, déplacez les glandes sous-mandibulaires de côté et retirez le muscle mastoïdien sternal pour exposer l’artère carotide commune et sa bifurcation, ainsi que les ganglions cervicaux supérieurs et retirez le tissu qui y est attaché. Disséquez la bifurcation de l’artère carotide droite et gauche et le tissu qui y est attaché.
Transférer chaque morceau de tissu disséqué dans une boîte de Petri séparée de 3,5 centimètres contenant du PBS froid. Localisez les ganglions cervicaux supérieurs attachés à la bifurcation carotidienne. Nettoyez les ganglions cervicaux supérieurs en enlevant l’artère et le tissu attaché.
Pour disséquer les ganglions étoilés, faites une coupe médiane dans l’abdomen, suivie de l’ouverture du diaphragme et de la paroi thoracique ventrale. Retirez les poumons, suivis du cœur, pour exposer le thorax dorsal. Au niveau de la première côte, localisez les ganglions étoilés gauche et droit antérolatéral au musculus colli longus.
Disséquez les deux ganglions stellaires avec une pince en enlevant le tissu environnant. Transférez-les dans des boîtes de Petri de 3,5 centimètres contenant du PBS froid. À l’aide de pinces, transférer les ganglions cervicaux supérieurs et les ganglions stellaires pour séparer des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis ajouter 500 microlitres de solution de trypsine-EDTA à 0,25% à chaque tube et incuber dans un bain-marie agité.
Laissez les ganglions se déposer au fond des tubes de microcentrifugation. Transférer le surnageant dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu ganglionnaire. Aux tubes de microcentrifugation, ajouter 500 microlitres de solution de collagénase de type 2 et incuber dans un bain-marie agité.
Après l’incubation, remettre les ganglions dans une solution de collagénase en pipetant jusqu’à ce que les amas de tissus ne soient plus détectés. Transférer la suspension cellulaire dans le tube de 15 millilitres précédemment utilisé contenant le milieu de culture des ganglions avec la suspension de trypsine-EDTA. Centrifugez la suspension de la cellule et jetez le surnageant de la cellule.
Remettre en suspension la pastille dans 270 microlitres de sérum fœtal bovin et la transférer dans un cryovial de 1 millilitre. Pour compter les cellules, mélanger 5 microlitres de la suspension de cellules ganglionnaires avec cinq microlitres de colorant bleu trypan à 0,4%. Chargez le mélange dans un hémocytomètre et comptez le nombre total et le nombre de cellules vivantes au microscope.
Ensuite, ajoutez 30 microlitres de diméthylsulfoxyde à chaque cryovial et mélangez bien. Transférez les cryoviales dans un récipient de congélation cellulaire et placez-le à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez des tubes de 15 millilitres avec une crépine de 30 micromètres sur le dessus.
Pré-rincer la passoire avec 1 millilitre de milieu ganglionnaire. Retirez les cryoviaux de l’azote liquide et décongelez-les immédiatement au bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une petite pastille de glace soit laissée dans le cryovial. Ajouter 1 millilitre du milieu ganglionnaire dans chaque cryovial tout en secouant soigneusement le flacon pour récupérer les cellules ganglionnaires.
Chargez la suspension de cellules ganglionnaires sur la passoire et rincez avec 4 à 5 millilitres de milieu ganglionnaire. Centrifugez la suspension de cellule tendue. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de tampon de lavage cellulaire.
Transférer la suspension de la cellule dans un tube de microcentrifugation à faible liaison de 0,5 millilitre. Centrifuger la suspension de la cellule. Une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant est désormais indispensable.
Après centrifugation, retirer 45 microlitres du surnageant sans déloger la pastille cellulaire. Ajouter 45 microlitres de tampon de lyse réfrigéré, doucement mélangés par pipetage, et incuber les cellules pendant 8 minutes sur de la glace, puis ajouter 50 microlitres de tampon de lavage à noyaux froids à chaque tube. Centrifugez la suspension des noyaux et retirez 95 microlitres du surnageant sans perturber la pastille de noyau.
Ajouter 45 microlitres de tampon de lavage des noyaux réfrigérés à la pastille, répéter la centrifugation et retirer le surnageant. À la pastille de noyau, ajoutez 50 microlitres de ST-SB et pipetez doucement jusqu’à ce que les noyaux soient complètement remis en suspension, puis ajoutez 5 microlitres de réactif bloquant FC et incubez pendant 10 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez 1 microlitre d’anticorps hashtag mono-noyau et incubez pendant 30 minutes sur de la glace.
Après l’incubation, ajoutez 100 microlitres de ST-SB à chaque tube. Centrifugez la suspension et retirez 145 microlitres du surnageant sans perturber la pastille de noyau. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant.
Remettre en suspension la pastille de noyau dans 50 microlitres de ST-SB et mélanger doucement. Prenez 5 microlitres de la suspension de noyaux et mélangez-les avec 5 microlitres de bleu de trypan à 0,4% pour compter les noyaux au microscope. Encore une fois, centrifugez la suspension des noyaux et remettez en suspension la pastille de noyaux dans ST-SB pour atteindre une concentration cible de noyaux de 1 000 à 3 000 noyaux par microlitre.
Tirez les échantillons pour obtenir le nombre de cellules souhaité. L’analyse du contrôle de la qualité pour la préparation de la bibliothèque a montré des ADNc oligo-dérivés de hashtags inférieurs à 180 paires de bases. Un large pic de 300 à 1 000 paires de bases représentait une bibliothèque d’expression génique de haute qualité, tandis qu’un pic spécifique de 194 paires de bases montrait la bibliothèque oligo de hashtags.
L’analyse du séquençage de l’ARN à noyau unique a révélé que 12 grappes ont été visualisées par UMAP et que des anticorps hashtag ont été distribués entre toutes les grappes. L’étiquetage spécifique par hashtag oligos a été confirmé par l’expression de Xist. Les hashtags 1 à 4 ont étiqueté les échantillons féminins, tandis que 5 à 8 ont étiqueté les échantillons masculins.
La qualité et la résolution des données de séquençage ont été vérifiées par des transcriptions clés telles que TH, DBH et SNAP25 dans les groupes 5 et 7 pour les neurones sympathiques, S100B dans les groupes 0 à 3 pour les cellules gliales satellites, PECAM 1 dans le groupe 4 pour les cellules endothéliales et ACTA2 dans le groupe 8 pour les cellules stromales. Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de se rappeler que la préparation appropriée et un équipement adéquat tel que des ciseaux à dissection fine, des pinces à épiler pointues et une centrifugeuse avec un rotor à godet oscillant sont essentiels. L’approche par étapes pour le séquençage de l’ARN mononuclé des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques a le potentiel d’une large application dans la caractérisation des ganglions innervant d’autres organes et tissus apparentés dans la santé et la maladie.
