이 JoVE 프로토콜에서는 액적 기반 단일 핵 RNA 시퀀싱을 사용하여 건강과 질병에서 심장 교감 신경 뉴런의 생물학적 구조를 특성화합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 많은 뉴런 샘플 수집의 시퀀싱을 가능하게 한다. 해시태그 올리고로 바코드된 핵을 잡아당기면, 이 방법은 샘플의 멀티플렉싱을 허용한다.
이 방법은 인간 신경절의 뉴런 시퀀싱으로 확장 될 수있는 잠재력을 보유하고 있으며, 이는 큰 세포 크기와 어려운 동시 샘플 수집으로 인해 어려웠습니다. 절차를 시연하는 것은 Conny van Munsteren, 연구 기술자 및 Lieke van Roon, 우리 실험실의 박사 과정 학생 해부에 필요한 모든 자료를 수집 한 다음 해부 보드에 마우스를 고정시킵니다. 모피의 분산을 최소화하기 위해 마우스를 70 % 에탄올로 적시십시오.
가위로 중간 선을 잘라 목 부위의 피부를 엽니 다. 스테레오 현미경으로 하악샘을 옆으로 옮기고 흉골 유양돌기 근육을 제거하여 일반적인 경동맥과 그 분기뿐만 아니라 우수한 자궁 경부 신경절을 노출시키고 부착 된 조직을 제거하십시오. 오른쪽과 왼쪽 경동맥 분기와 그것에 부착 된 조직을 해부하십시오.
해부된 각 조직 조각을 차가운 PBS를 함유하는 별도의 3.5센티미터 페트리 접시로 옮긴다. 경동맥 분기에 부착 된 우수한 자궁 경부 신경절을 찾으십시오. 우수한 자궁 경부 신경절을 동맥과 부착 조직을 제거하여 청소하십시오.
별자리 신경절을 해부하려면 복부에서 중간 선을 자른 다음 횡격막과 복부 흉부 벽을 엽니 다. 폐를 제거하고 심장을 제거하여 등쪽 흉부를 노출시킵니다. 첫 번째 갈비뼈의 수준에서, 왼쪽 및 오른쪽 별자리 신경절 전측을 근육 콜리 롱구에 배치하십시오.
두 별자리 신경절 둘레를 포셉으로 해부하여 주변 조직을 제거하십시오. 차가운 PBS가 들어있는 3.5 센티미터 페트리 접시에 옮깁니다. 포셉을 사용하여 우수한 자궁 경부 신경절과 별자리 신경절을 옮겨 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브를 분리 한 다음 0.25 % 트립신-EDTA 용액 500 마이크로 리터를 각 튜브에 추가하고 진탕 수조에서 배양하십시오.
신경절이 마이크로 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록하십시오. 상청액을 5 밀리리터의 신경절 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브에 500 마이크로리터의 콜라게나제 타입 2 용액을 첨가하고 진탕 수조에서 배양한다.
인큐베이션 후, 조직 덩어리가 더 이상 검출되지 않을 때까지 피펫팅하여 콜라게나제 용액에 신경절을 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 트립신-EDTA 현탁액과 함께 신경절 배양 배지를 함유하는 이전에 사용된 15밀리리터 튜브로 옮긴다. 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 상층액을 버린다.
펠렛을 270 마이크로리터의 태아 소 혈청에 재현탁시키고 1밀리리터 cryovial로 옮긴다. 세포를 계수하려면 5 마이크로 리터의 신경절 이온성 세포 현탁액을 5 마이크로 리터의 0.4 % 트리판 블루 염료와 혼합하십시오. 혼합물을 혈구계에로드하고 현미경으로 총 및 살아있는 세포 수를 계산하십시오.
다음으로, 30 마이크로 리터의 디메틸 설폭사이드를 각 냉동 장치에 첨가하고 잘 섞으십시오. 냉동 장치를 세포 냉동 용기에 넣고 하룻밤 사이에 영하 80도에 두십시오. 위에 30 마이크로 미터 스트레이너가있는 15 밀리리터 튜브를 준비하십시오.
1 밀리리터의 신경절 배지로 스트레이너를 미리 헹구십시오. 액체 질소에서 냉동 장치를 꺼내 즉시 섭씨 37 도의 수조에서 해동하여 작은 얼음 알갱이가 냉동 장치에 남을 때까지 해동하십시오. 신경절 배지 1 밀리리터를 각 냉동 장치에 넣고 조심스럽게 바이알을 흔들어 신경절 이온 세포를 회수하십시오.
신경절 이온성 세포 현탁액을 스트레이너에로드하고 4 ~ 5 밀리리터의 신경절 배지로 헹구십시오. 변형된 세포 현탁액을 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 50 마이크로리터의 세포 세척 완충액에 재현탁시켰다.
세포 현탁액을 0.5밀리리터 저결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포 현탁액을 원심분리한다. 스윙 버킷 로터가있는 원심 분리기는 지금부터 필수적입니다.
원심분리 후, 세포 펠릿을 분산시키지 않고 상층액 45 마이크로리터를 제거하였다. 45 마이크로리터의 냉각 용해 완충액을 첨가하고, 피펫팅에 의해 부드럽게 혼합하고, 얼음 위에서 8분 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 50 마이크로리터의 차가운 핵 세척 완충액을 각 튜브에 첨가한다. 핵 현탁액을 원심분리하고 핵 펠릿을 파괴하지 않고 상층액 95 마이크로리터를 제거한다.
냉각된 핵 세척 완충액 45 마이크로리터를 펠렛에 첨가하고, 원심분리를 반복하고, 상청액을 제거한다. 핵 펠릿에 50 마이크로 리터의 ST-SB를 첨가하고 핵이 완전히 재현탁 될 때까지 부드럽게 피펫을 한 다음 5 마이크로 리터의 FC 차단 시약을 첨가하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오. 다음으로, 1 마이크로리터의 단일 핵 해시태그 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 100 마이크로리터의 ST-SB를 각 튜브에 첨가한다. 현탁액을 원심분리하고 핵 펠릿을 파괴하지 않고 상청액 145 마이크로리터를 제거한다. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거한다.
핵 펠렛을 50 마이크로리터의 ST-SB에 재현탁시키고 부드럽게 혼합한다. 핵 현탁액 5 마이크로 리터를 취하여 0.4 % 트리판 블루 5 마이크로 리터와 혼합하여 현미경으로 핵을 계산하십시오. 다시, 핵 현탁액을 원심분리하고, 핵 펠릿을 ST-SB에 재현탁시켜 마이크로리터 당 1, 000 내지 3, 000 핵의 표적 핵 농도를 달성한다.
원하는 수의 세포를 얻기 위해 샘플을 당깁니다. 라이브러리 준비를위한 품질 관리 분석은 해시 태그 oligo-derived cDNAs가 180 염기 쌍보다 작은 것으로 나타났습니다. 300 내지 1의 넓은 피크, 000 염기쌍은 고품질 유전자 발현 라이브러리를 나타내는 반면, 194 염기쌍의 특정 피크는 해시태그 올리고 라이브러리를 나타냈다.
단일 핵 RNA 시퀀싱 분석은 UMAP에 의해 시각화 된 12 개의 클러스터와 해시 태그 항체가 모든 클러스터에 분포 된 것으로 나타났습니다. 올리고해시태그에 의한 구체적인 표지는 Xist의 발현에 의해 확인되었다. 해시 태그 1 ~ 4 개의 라벨이 붙은 여성, 5 ~ 8 개의 라벨이 붙은 남성 샘플.
시퀀싱 데이터의 품질과 분해능은 교감신경 세포에 대한 클러스터 5 및 7의 TH, DBH 및 SNAP25, 위성 신경교 세포의 경우 클러스터 0 내지 3의 S100B, 내피 세포의 경우 클러스터 4의 PECAM 1, 기질 세포의 경우 클러스터 8의 ACTA2와 같은 주요 전사체에 의해 검증되었습니다. 이 방법을 시도 할 때 적절한 준비를 기억하는 것이 중요하며 미세 해부 가위, 날카로운 핀셋 및 스윙 버킷 로터가있는 원심 분리기와 같은 적절한 장비가 필수적입니다. 교감 신경 외인성 심장 신경절의 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대한 단계적 접근법은 건강 및 질병에서 다른 관련 기관 및 조직을 신경과민하는 신경절을 특성화하는 데 광범위한 적용 가능성을 갖는다.
