Наш протокол открывает новые возможности для исследования того, как происходит репликация на поврежденной ДНК. Методы могут обнаруживать образование и восстановление одноцепочечных разрывов ДНК, противоположных поражению ДНК. Нуклеаза S1 расщепляет одноцепочечную ДНК и позволяет обнаруживать пострепликтивные промежутки.
Этот подход был впервые использован доктором Менегини и доктором Кордиеро-Стоуном в 1970-х годах в Бразилии и недавно адаптирован нами к анализу волокон ДНК. Использование техники, описанной здесь, для изучения образования и восстановления пострепликативных пробелов может дать представление о механизме репарации ДНК и реакции на стресс репликации, которые поддерживают целостность генома. Для обоих протоколов, описанных здесь, волокна S1 и анализов, заполняющих пробелы, крайне важно включить все элементы управления для обеспечения точной интерпретации данных.
Процедура будет продемонстрирована Дави Мартинсом, аспирантом из нашей лаборатории, и доктором Аннабель Куинет, сотрудником, который ранее разработал эти методы при работе в нашей группе. Для начала аспирируйте питательные среды и сразу же добавляйте в клетки питательные среды с 20-микромолярной средой IDU. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ровно 20 минут.
Затем быстро промыть клетки предварительно нагретым PBS дважды и облучить их 20 джоулями на квадратный метр UV-C. Используйте необработанные клетки в качестве элементов управления. Немедленно добавьте в клетки среду с 200-микромолярным CldU и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ровно 60 минут.
После этого дважды промывайте клетки предварительно подогретым PBS и пронизывайте их буфером CSK 100 в течение от двух до 10 минут в соответствии с клеточной линией при комнатной температуре. После пермеабилизации ЦСК можно увидеть ядра почти без цитоплазмы по сравнению с ядрами до пермеабилизации. Осторожно вылейте PBS вниз по бокам каждой лунки, чтобы промыть ядра PBS.
Затем промыть ядра буфером S1. Инкубируйте ядра в буфере S1 с 20 единицами на миллилитр нуклеазы S1 и без нуклеазы S1 в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Затем аспирируйте буфер S1 и добавьте 0,1% BSA в PBS.
Соскоблите ядра и перенесите их в примерно аннотированную 1,5-миллилитровую трубку. Держите трубки на льду все время. Центрифугируйте ядра примерно в 4, 600 раз больше G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Повторно суспендировать гранулы в PBS в концентрации приблизительно 1 500 клеток на микролитр. Поместите трубки на лед и сразу же приступайте к приготовлению волокна ДНК по протоколу распространения. Аннотируйте слайды микроскопа углеродным карандашом и разложите их плоско на подносе.
Нажмите на нижнюю часть трубки, чтобы обеспечить гомогенизацию, и добавьте два микролитра клеток в верхнюю часть соответствующего слайда. Добавьте шесть микролитров буфера лизиса и лизируйте клетки, пипетируя вверх и вниз примерно пять раз. Используйте наконечник пипетки, чтобы немного потянуть каплю к нижней части слайда и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы лизировать ядра.
Наклоните горку примерно на 20-40 градусов и позвольте капле распространиться на нижнюю часть слайда с постоянной низкой скоростью. Дайте слайду высохнуть при комнатной температуре в темноте в течение 10-15 минут. Затем погрузите их в банку, содержащую свежеприготовленный фиксирующий раствор, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать ДНК на слайдах.
Дважды вымойте слайды PBS в течение пяти минут и денатурируйте ДНК свежеприготовленной 2,5-молярной клоридриновой кислотой в течение 40-60 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды PBS три раза в течение пяти минут и блокируйте с 5% BSA, предварительно нагретым в течение 30-60 минут при 37 градусах Цельсия. Осторожно постучите по бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость со слайдов.
Добавьте 30 микролитров первичных антител к слайдам по каплям и поместите сверху крышку. Инкубировать в течение 1 - 1,5 часов при комнатной температуре в темной, влажной камере. Поместите слайды в банку с PBS на одну-две минуты, а затем аккуратно снимите крышку.
Вымойте PBST в банке три раза в течение пяти минут и поместите слайды в PBS. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постучав по бумаге, и добавьте 30 микролитров вторичных антител к слайдам по каплям. Сверху поместите крышку.
Инкубировать в течение 45-60 минут при комнатной температуре в темной и влажной камере. Повторите шаги по промывке слайдов и удалению избытка PBS еще раз и добавьте 20 микролитров монтажного реагента по каплям к слайдам. Положите сверху крышку и избегайте пузырьков.
Поместите каплю погружного масла в верхнюю часть слайда, где ячейки были лизированы. Используйте зеленый канал и выполните поиск по зеленым точкам в фоновом режиме, чтобы найти фокус. Откройте программное обеспечение Leica Application Suite, нажмите «Получить» и выберите зеленый канал.
Отрегулируйте настройки зеленого канала перед анализом. Затем перейдите на красный канал и настройте настройки. Найдите основную концентрацию волокон и двигайтесь к краям, чтобы найти хорошо распространенные, не перекрывающиеся, отдельные волокна.
Используйте только один канал, чтобы выбрать регионы для изображений и избежать потенциального смещения. Нажмите на значок «Получить наложение» и настройте программное обеспечение для правильного увеличения микроскопа. Сделайте от 15 до 20 снимков на слайд вместе со всем слайдом на зеленом канале, а затем на красном канале.
Теперь два канала объединены, а созданный наложение перемещается в уникальную папку. Можно увидеть волокна красного и зеленого цветов. Откройте программное обеспечение ImageJ, щелкните левой кнопкой мыши пятый значок, выберите второй вариант, а затем выберите инструмент Сегментированная линия.
Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы нарисовать точный контур красного или зеленого тракта, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы остановить рисунок. Нажмите кнопку M на клавиатуре, чтобы измерить длину. Для волокна S1 отслеживайте измерения красного и зеленого трактов для каждого волокна и измеряйте длины красного и зеленого трактов по крайней мере от 150 волокон из разных изображений.
На этих репрезентативных изображениях показано волокно S1. Здесь показан контрольно-зарождающийся тракт ДНК без разрывов и непроницаемый для расщепления нуклеазой S1. Положительный результат ДНК-тракта на промежутки, расщепленные нуклеазой S1, привел к более короткой длине тракта CldU.
Схема дифференциальной маркировки, подробно описанная в рукописи текста, может быть выполнена для обозначения событий заполнения пробелов. В этом анализе, называемом анализом заполнения пробелов, более длинные следы IDU с по крайней мере одним участком CldU или меньшим количеством пластырей CldU соответствуют низкой плотности заполнения зазоров. Более короткие тракты IDU, по крайней мере, с одним пластырем CldU, и более длинные тракты IDU с большим количеством участков CldU соответствуют высокой плотности заполнения зазоров.
Стадия пермеабилизации этого протокола имеет решающее значение для того, чтобы нуклеаза S1 действовала на промежутки, образующиеся во время репликации поврежденной ДНК. Нуклеаза S1 также может быть использована в протоколе кометного анализа для обнаружения пробелов, образующихся во время репликации поврежденной ДНК, которая сохраняется после лечения. Анализ волокон S1 проложил путь к новой парадигме, согласно которой пострепликационные промежутки могут вызывать уязвимость к раку, особенно при раке молочной железы и яичников, несущем мутации в генах BRCA1 и 2.
