Рак молочной железы является наиболее распространенным раком и второй по значимости причиной смерти, связанной с раком, для женщин в США. Современные подходы к профилактике ограничены и сопровождаются различными неблагоприятными побочными эффектами. Необходимы новые мероприятия по первичной профилактике. Мы разработали метод внутрипротоковой доставки абляционного раствора на основе этанола к эпителию молочной железы мыши для профилактики рака молочной железы.
Инъекция непосредственно в отверстие соска позволяет нацеливать эпителиальные клетки, выстилающие протоковое дерево, с минимальным повреждением коллатеральной ткани. Этот метод позволяет одновременно получать изображения in vivo с использованием наночастиц оксида тантала в качестве контрастного вещества высокого разрешения. Этот метод может быть адаптирован для использования с другими рентгеноконтрастными агентами и различными профилактическими обработками различными химическими или термическими абляционными растворами.
Первым шагом, связанным с этим методом визуализационной профилактики рака молочной железы, является индуцирование расширенного противовоспалительного лечения путем перорального дозирования карпрофена с использованием чашек с сукралозным гелем, приготовленных в лаборатории. Мы готовим животное, используя крем для депиляции, чтобы удалить шерсть из области, окружающей соски, подлежащие инъекции. Затем внутрипротоковые инъекции выполняются с помощью стереоскопа, чтобы наилучшим образом найти и визуализировать отверстие соска для введения иглы.
После доставки раствора животных визуализируют с помощью микро-КТ или рентгеноскопии, чтобы определить, насколько успешными были инъекции. Микро-КТ сканирование может быть обработано для создания 3D-реконструкций введенного дерева протоков молочной железы для дальнейшего анализа успешного наполнения и других показателей. Сначала готовят карпрофен в необходимой концентрации.
Мы делаем рабочий раствор по два мг на мл для инъекции 0,5 мл и достигаем конечной дозы в один мг на чашку. Вы можете добавить в смесь стерильный пищевой краситель, чтобы лучше подтвердить полное смешивание препарата с сукралозой чашки. Затем поместите чашки на водяную баню при температуре 60 градусов Цельсия на 15 минут.
Снимите чашки и высушите их, чтобы свести к минимуму возможность загрязнения. Используйте 70% этанол или этаноловые салфетки, чтобы очистить поверхность крышки чашки и дать высохнуть. Используйте шприц для введения необходимого количества раствора карпрофена через крышку.
В этом случае нам нужно ввести 500 микролитров для желаемого результата. Поместите наклейку на отверстие от иглы и встряхните чашку в течение 15 секунд, прежде чем вихрь в течение дополнительных 15 секунд. Проверьте чашку на однородное перемешивание, ища комочки темно-синего цвета.
Затем чашки могут быть охлаждены в течение месяца. Подготовка животного должна происходить за два-три дня до внутрипротоковой процедуры. Начните с обезболивания животного с помощью изофлурана.
Перенесите обезболенную мышь в носовой конус, который продолжает доставлять изофлуран. Нанесите смазку для глаз на мышь, находясь на носовом конусе, а затем поместите мышь на спину. Используйте аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы нанести крем для депиляции на область молочных желез, которые вы планируете ввести.
Втирайте аппликатор вверх и вниз по коже животного в нужной области, чтобы помочь с более быстрым ослаблением шерсти. Важно оставить крем на мышах как можно меньше времени, чтобы избежать обжига кожи. После 10-30 секунд нанесения используйте теплую воду на марле, чтобы полностью удалить крем.
Используйте от двух до четырех ополаскивателей, чтобы обеспечить полное удаление перед сушкой кожи чистой марлей. Проверьте участки удаления меха, чтобы подтвердить хорошую видимость и доступ к соскам. При необходимости повторите процедуру депиляции.
Поместите мышь в чистую клетку для восстановления на согревающей подушке, чтобы восстановиться после анестезии. Дайте одну чашку карпрофена, чтобы подготовить мышей в их домашней клетке после выздоровления. Вы снова начнете с обезболивания животного с помощью изофлурановой анестезии и переместите мышь к конусу носа, как только он будет полностью индуцирован.
Глазная смазка будет наноситься перед тем, как поместить животное на спину для инъекций. Может быть полезно заклеить ноги возле молочных желез, которые будут введены, но не обязательно. Подготовьте шприц с нужным объемом инъекционного раствора плюс один микролитр на случай, если что-то выльется после удаления иглы.
Может быть полезно заполнить дополнительным объемом, чтобы проверить иглу на свободный поток раствора непосредственно перед инъекцией. Если вводить более одной молочной железы, это может сэкономить время для предварительного заполнения нескольких шприцев, если таковые имеются. Позаботьтесь о том, чтобы не делать это слишком рано, если раствор склонен к засорению, когда его оставляют сидеть.
Подготовьте сосок, удалив любую видимую мертвую кожу, используя тонкие щипцы, если это возможно. Не стоит удалять всю омертвевшую кожу, если она не блокирует отверстие соска и устойчива к подергиванию. Иногда это может привести к травме и отеку соска, если мертвая кожа прикреплена к живой коже слишком плотно.
Когда виден скос иглы, вставьте иглу в отверстие соска с помощью тонких наконечников щипцов. В зависимости от длины и упругости соска, не всегда можно удерживать сосок во время направления в игле. Иногда необходимо маневрировать соском с помощью иглы, чтобы щипцы могли тянуть сосок вверх над иглой, а не направлять иглу вниз в сосок.
Как только скос иглы будет полностью окружен соском и в главный проток, начните медленно вводить раствор. Желаемая скорость составляет примерно 40 микролитров в минуту. Избегайте инъекций быстрее, чем это, чтобы предотвратить возможное повреждение протокового дерева.
После полной инъекции подождите 30 секунд, прежде чем вынуть иглу из соска с помощью щипцов. Это позволит свести к минимуму любую утечку из соска. Оцените площадь на наличие каких-либо признаков неудачной инъекции.
Появление купола может указывать на инъекцию жировой подушки или травму области. Часто можно увидеть, что инъекция в жировую подушку происходит, если раствор содержит краситель или если вы внимательно ищете купол в месте инъекции, как можно увидеть здесь. Продолжайте вводить оставшиеся молочные железы, необходимые для вашего эксперимента, аналогичным образом, отмечая объемы инъекций и любые случаи утечки.
Некоторые области мыши может быть сложнее ввести из-за таких проблем, как неловкое расположение рук или помехи дыханию. Например, правостороннему инжектору, вероятно, будет труднее всего вводить железы в верхней правой части мыши, как показано здесь. Они больше двигаются из-за близости к легким, и может быть трудно найти хорошее расположение руки с телом животного таким образом, чтобы упереть запястье в поверхность.
Некоторым может быть легче переместить мышь, если носовой конус позволяет. При инъекционном введении этанолсодержащего раствора необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать системной алкогольной интоксикации. Это требует знания того, сколько этанола может быть введено за один сеанс и введения раствора, содержащего сахарозу, ВО время процедуры для противодействия эффектам.
После внутрипротоковой процедуры животные могут быть восстановлены в чистой клетке на грелке или перемещены в систему микро-КТ для визуализации заполненных протоков деревьев. Мышь также должна быть восстановлена после любого сеанса визуализации. После перемещения введенного животного в систему микро-КТ продолжайте введение изофлурана для поддержания анестезии во время визуализации.
Может быть полезно стандартизировать положение изображения, заклеив ноги рядом с участком, который будет изображен. Например, заклеивание задних ног в вытянутом положении может удерживать кость ног от препятствования обзору введенных желез. Заклеивание передних ног в вытянутом вверх положении может также помочь в просмотре верхних желез.
Мы также обнаружили, что тейпирование по брюшной полости мыши может помочь в уменьшении дыхательного артефакта для нижних желез. Существует множество приемлемых параметров сканирования для визуализации протокового дерева. Всегда следует следить за тем, чтобы доза облучения, полученная в результате этих сканирований, не превышала предельных значений радиации для данного штамма мышей.
Дозирование излучения может быть значительно уменьшено путем просмотра рентгеноскопии и отметки успеха доставки, а не получения изображений с более длительным временем экспозиции. Наши стандартные параметры сканирования приемлемы для повторного изображения, если только для получения коротких двухминутных стандартных сканирований. Более длительное сканирование с более высоким разрешением до 14 минут приемлемо в качестве терминальной процедуры перед эвтаназией.
Эти более длительные сканирования не приемлемы для продольных исследований, поскольку они могут вызвать лучевую болезнь у животных. Этому животному вводили раствор этанола, содержащий 100 миллимоляров контраста оксида тантала в железах четыре и девять. Текущее приобретение представляет собой 14-минутное сканирование с высоким разрешением введенных нижних желез.
Рентгеноскопия животного позволяет увидеть архитектуру протокового дерева, выделяемую контрастом внутри инъекционного раствора. Используемая нами система микро-КТ имеет встроенное программное обеспечение, которое позволяет создавать быстрые представления для оценки успешности инъекции без формального анализа. Эта функция имеет простой контрастный ползунок, который обеспечивает разумное снижение сигнал-шум.
Ограничение этих представлений заключается в том, что одни и те же пороговые значения сигнала применяются ко всему изображению. Это позволяет ярким сигналам, которые явно не являются частью протокового дерева, таким как железо в рационе, оставаться в представлении. Лучшие формальные представления могут быть сделаны с использованием более сложного аналитического программного обеспечения, которое позволяет сегментировать интересующую область.
Чтобы получить наилучший рендеринг дерева единственного протока, мы рекомендуем сегментировать жировую прокладку молочного железа для дальнейшей обработки изображения. Этот процесс требует линии, прослеживающей границы жировой подушки по всей толщине животного. Мы обнаружили, что трассировки каждого третьего среза и распространения объекта достаточно, чтобы захватить весь проток.
Это может быть субъективный процесс, который требует соблюдения лабораторных стандартов для отслеживания, чтобы обеспечить одинаковый результат от всех лиц, анализирующих сканы. Знакомство с анатомией может помочь с суждениями о том, какие области следует включить. После распространения следов можно установить порог представления в определенном диапазоне, чтобы отобразить только контраст, содержащийся в молочной железе.
Это должно быть решение внутри протокового дерева, а также любая утечка в непосредственной близости. Диапазон от 300 до 3000 HU имеет тенденцию хорошо работать в случае растворов, содержащих оксид тантала. Пример полностью обработанного представления можно увидеть здесь в нескольких аспектах.
В зависимости от того, как животное ориентировано в микро-КТ, может потребоваться переориентировать файлы DICOM в аналитическом программном обеспечении, чтобы представить интуитивно понятное анатомическое позиционирование с головой животного в верхней части изображения. Также может быть трудно определить, какая железа просматривается, если вы не заботитесь о том, чтобы поворачивать изображение аналогичным образом каждый раз. Дальнейшие измерения, такие как объем или длина, могут быть сделаны после того, как вы создали реконструкцию протокового дерева.
Подтверждение успешной доставки с помощью этой процедуры может быть продемонстрировано не только с помощью 3D-микро-КТ-представлений, как описано здесь, но и с помощью целых креплений с двойным окрашиванием с инжекторным синим Эвансом, перекрывающим все протоковое дерево, выделенное квасцами кармина. 3D-конфокальная микроскопия может выделить архитектуру протокового дерева в очищенной железе, окрашенной электронным кадгерином. Вариабельность от штамма к штамму и от мыши к мыши и анатомия сосков могут более или менее затруднить инъекцию желез.
Это пример идеального соска для инъекций с высоким профилем для удобства захвата. Соски с более низкими профилями, такие как этот, может быть сложнее успешно канюлировать. Эти различия могут повысить вероятность достижения успешной инъекции без травмы или доминирования, как показано здесь, или с большей вероятностью быть неудачной, как показано куполообразным внешним видом этой инъекции жировой подушки.
Когда дело доходит до профилактики рака молочной железы, в настоящее время используются две основные тактики. Первое, бдительное ожидание, не предполагает истинного вмешательства. Люди, идущие по этому пути, регулярно контролируются на наличие любых комков в ткани молочной железы, которые указывают на образование рака.
Обнаружение болезни затем приведет к лечению. Профилактическая мастэктомия является более инвазивной процедурой, которая удаляет все эпителиальные клетки, из которых может возникнуть рак молочной железы вместе с окружающей стромой. Эта операция может иметь серьезные неблагоприятные побочные эффекты и редко выбирается в качестве профилактического варианта для лиц с низким или умеренным риском заболевания.
Наш подход включает в себя локальную эпителиальную абляцию путем инъекции абляционного раствора непосредственно в дерево протоков молочной железы. Этот метод уменьшает сопутствующий ущерб и, вероятно, будет более привлекательным вариантом для лиц, не подверженных серьезному риску заболевания. Добавление контраста для немедленной визуализации после инъекции также делает это легко переводимым в клинику.
